双须骨舌鱼抗缪勒氏管激素基因amh的克隆、组织表达分析和原核表达

为探究双须骨舌鱼抗缪勒氏管激素基因amh的作用和表达模式,本研究通过RACE技术克隆了双须骨舌鱼amh基因全长c DNA序列,发现存在amh1、amh2两个亚型(Gen Bank登录号KU378662、KU378663)。序列分析结果显示,双须骨舌鱼amh1基因的c DNA全长2277 bp,编码623个氨基酸,amh2基因c DNA全长2181 bp,编码355个氨基酸。同源性分析显示,amh基因保守性较低,双须骨舌鱼与同科的美丽硬仆骨舌鱼相似度最高,为85.64%,与不同科鱼类的相似度均低于42%。系统进化分析显示,该基因与骨舌鱼目聚为一支,与鲱形目、鲤形目等较低等的硬骨鱼类亲缘关系较近,与双须骨舌鱼进化地位相符。用荧光定量PCR检测的结果显示,amh基因在双须骨舌鱼不同组织中均有表达,其中amh1亚型在精巢中表达量最高,且明显高于卵巢和其他组织;amh2亚型也在精巢中表达量最高,且明显高于其他组织,但远远低于amh1在精巢中的表达。构建了原核表达载体p ColdⅠ-amh1和p ColdⅠ-amh2并在大肠杆菌中成功诱导出大小分别为68和48 ku的融合蛋白,为进一步研究amh在双须骨舌鱼体内的生物功能奠定了基础。     

双须骨舌鱼转录组EST-SSR标记开发与引物筛选

利用MISA软件对双须骨舌鱼(Osteoglossum bicirrhosum)性腺转录组测序获得的188 461条Unigene进行SSR检测,结果在11 917个Unigene中共检测到SSR位点12 578个,其中包含2个及以上SSR位点的Unigene有633个。SSR的发生频率为6.32%,平均分布距离为9 949 bp。在筛选到的SSR位点中,优势重复基序为二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸,其中二核苷酸重复基序数量最多,占总数的50.52%。重复基元类型共216种,其中数量最多的类型为二核苷酸重复AC/GT,占总数的20.66%。从所有筛选出的SSR位点中随机选取50个位点并运用Primer Premier 5.0设计引物,共有25对引物成功扩增出特异性产物,并且均在同科的美丽硬仆骨舌鱼(Scleropages formosus)的三个亚种中通用。结果表明,转录组测序产生的EST序列是开发SSR标记的有效来源,开发所得EST-SSR引物可用于双须骨舌鱼及其近缘物种遗传分析、遗传图谱构建以及分子标记辅助育种等工作中。     

双须骨舌鱼性腺发育的组织学观察

通过组织学研究方法,分别对双须骨舌鱼Ⅱ~Ⅴ期的卵巢及Ⅱ~Ⅵ期精巢的形态结构、特征及生殖细胞变化进行描述。结果显示,Ⅱ时相卵母细胞的细胞核较大,约为细胞体积的一半;Ⅲ时相卵母细胞出现卵黄斑及卵黄颗粒;Ⅳ时相卵母细胞中卵黄迅速积累且细胞膜出现褶皱;Ⅴ时相卵母细胞膜表面的褶皱消失。雄性双须骨舌鱼精巢发育的Ⅱ期,只含有初级精母细胞。Ⅲ期精巢分布有初级和次级精母细胞,精小管形成且小管中充满精细胞;Ⅳ期精巢主要含有初级和次级精母细胞以及精原细胞,精小管中出现空腔;Ⅴ期精巢中包含次级精母细胞、精原细胞和精子细胞,精小管中的空腔增大;Ⅵ期精巢则显示出高度血管化和结缔组织增多等特点。本研究将为双须骨舌鱼人工繁殖提供参考。     

三疣梭子蟹Drosha和Exportin 5基因克隆及其在性腺发育过程中的表达分析

本研究利用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Drosha和Exportin 5基因的cDNA全长序列,Drosha基因长度为3443 bp,编码1038个氨基酸,预测蛋白质包含2个相邻的RNA酶Ⅲ结构域(RⅢDa和RⅢDb)和1个双链RNA结合结构域(dsRBD)。Exportin 5基因全长为5000 bp,编码1208个氨基酸,预测蛋白质包含1个Importin-βN-末端结构域(IBN-N)和1个核输出蛋白结构域(XPO-1)。同源分析显示,三疣梭子蟹Drosha氨基酸序列与其他物种高度相似,与日本对虾(Marsupenaeus japonicus)相似度最高,达94%。qRT-PCR分析结果显示,Drosha和Exportin 5基因在三疣梭子蟹各组织中均有表达,其在卵巢和肝胰腺中的表达量最高(P0.05);在精巢不同发育时期,2个基因表达量的变化趋势一致,均在Ⅱ期(精母细胞增殖、分化期)表达量最高;在卵巢发育过程中,2个基因表达量的变化趋势也大致相同,随着卵巢发育(Ⅱ~Ⅴ期)逐渐升高。研究表明,Drosha和Exportin 5基因可能通过调控miRNA的合成来影响三疣梭子蟹性腺发育过程,为深入解析三疣梭子蟹性腺发育调控机制提供了重要参考。     

金钱鱼促性腺激素受体基因克隆及其在性腺发育不同时期mRNA表达水平的分析

为了解金钱鱼促性腺激素受体基因(GtHRs)在金钱鱼性腺发育中的作用,采用反转录PCR(Rt-PCR)与cDNA末端快速克隆(RACE)首次克隆了金钱鱼卵泡刺激素受体(FSHR)和促黄体生成素受体(LHR)的cDNA序列全长。FSHR的cDNA全长2538 bp,编码702个氨基酸,LHR的cDNA全长3315 bp,编码722个氨基酸,它们都含有属于糖蛋白激素受体(GHR)家族的典型跨膜螺旋结构区域(TM helix)。同源性分析显示金钱鱼GtHRs与欧洲鲈的相似性最高,且GtHRs在进化中具有一定的保守性。性腺不同时期表达分析表明,在卵巢Ⅰ期时,FSHR高水平表达,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期时在较低水平表达。在精巢中,FSHR的表达水平在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期逐渐升高并在Ⅲ期达到最高,Ⅳ期开始下降。LHR在金钱鱼卵巢和精巢的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期低水平表达,在Ⅳ期表达水平达到最高。研究表明,FSHR在金钱鱼性腺发育早期扮演重要作用,LHR与卵子和精子的成熟有关。     

中华鳖dnd基因克隆及在生殖细胞中的表达

为了研究龟鳖类生殖细胞发育分化机制,实验通过RACE技术克隆获得了中华鳖dead end (dnd)基因全长c DNA,RT-PCR分析了其在不同组织的转录表达情况,并通过原位杂交技术检测了dnd mRNA在中华鳖雌雄性腺配子发生过程中的表达变化。结果显示,中华鳖dnd cDNA全长1 251 bp (GenBank登录号为OL757532),包括234 bp的3’端非翻译区和1 017 bp开放读码框,开放读码框编码338个氨基酸。氨基酸序列比对和系统进化树分析结果表明,中华鳖Dnd蛋白与其他物种同源蛋白一样,均具有6个保守的结构域,其中高度保守的RNA识别结构域是主要的功能结构域。中华鳖Dnd与绿海龟Dnd氨基酸序列一致性最高,亲缘关系最近。RT-PCR结果显示,Psdnd特异性地在中华鳖性腺组织中表达,且在卵巢中的表达明显高于精巢。原位杂交分析结果显示,Psdnd mRNA在生殖细胞中特异表达。在卵巢中,Psdnd mRNA主要在Ⅱ期初级卵母细胞的细胞质中表达,随着卵母细胞的增大,在Ⅳ期及以后的卵母细胞中检测不到其表达。在精巢中,Psdnd mRNA信号在初级精母细胞中表达最强,...     

海湾扇贝Dmrt1基因分子特征及功能分析

利用 PCR 技术和生物信息学方法获得了海湾扇贝(Argopecten irradians irradians) Dmrt1 基因(AiDmrt1)的 cDNA 序列。采用实时定量 PCR 技术确定 AiDmrt1 在不同组织、性腺发育阶段及胚胎和幼虫发育阶段的表达模式, 并结合 RNA 干扰(RNA interference, RNAi)技术敲降 AiDmrt1 表达后检测了精巢中性腺发育相关基因的表达特征。 结果显示, AiDmrt1 开放阅读框长度为 918 bp, 编码 305 个氨基酸, 其编码蛋白具有保守的 DM 结构域。AiDmrt1 的 mRNA 在精巢中特异性表达, 并在精巢发育至生长期表达水平最高。AiDmrt1 在囊胚期前表达量无显著差异, 但在原肠期表达水平显著升高(P＜0.01)。敲降 AiDmrt1 表达后, 精巢发育相关基因 Sox7、Sox11 和 Fem-1 显著上调表达(P＜0.05 或 P＜0.01), 而 Dmrt4 的表达显著下调(P＜0.05); 卵巢发育相关基因 FoxL2、Wnt4、β-catenin、GATA-1 和 GATA-3 均显著上调表达(P＜0.05 或 P＜0.01)。研究结果表明, AiDmrt1 是海湾扇贝精巢特异性表达基因, 参与调控海湾扇贝性腺发育与分化。     

半滑舌鳎孕酮受体膜组分1基因的克隆及组织和时空表达规律

运用同源克隆和RACE方法获得了半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)孕酮受体膜组分1(PGRMC1)的c DNA全长序列,生物信息学分析显示,半滑舌鳎PGRMC1 c DNA序列全长1335 bp,开放阅读框长546 bp;其编码的蛋白是单次跨膜蛋白,在N端13~35位氨基酸残基处有一个跨膜区域。半滑舌鳎PGRMC1氨基酸序列与青鳉(Oryzias latipes)相似性最高,达到了82.9%;与青斑河鲀(Tetraodon nigroviridis)相似度为81.2%。系统进化分析表明,半滑舌鳎PGRMC1与鳉形目和鲀形目鱼类PGRMC1聚为一个分支。采用实时荧光定量RT-PCR技术研究发现,性成熟雌性半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在各组织广泛表达,其中在卵巢组织中相对表达量最高(P0.05)。在不同卵巢发育时期,半滑舌鳎PGRMC1 m RNA在脑、垂体和卵巢中的周期表达变化特征显示:脑中PGRMC1 m RNA在卵巢Ⅲ期表达量升高明显,Ⅴ期表达水平最高(P0.05);垂体中PGRMC1 m RNA表达量在卵巢发育Ⅴ期达峰值(P0.05);在卵巢中,PGRMC1 m RNA表达水平从卵巢发育Ⅱ到Ⅴ期稳步上升,Ⅴ期时达到最高值(P0.05)。综上,半滑舌鳎PGRMC1基因主要参与卵巢的发育和成熟过程,并在繁殖期介导孕酮调控卵母细胞的最终成熟,研究结果为半滑舌鳎繁殖内分泌调控研究提供了基础资料。     

金钱鱼抗缪勒氏管激素基因克隆及其在性腺发育不同时期mRNA表达水平的分析

为了解抗缪勒氏管激素基因(AMH)在金钱鱼性腺发育中的作用,本研究利用RACE技术克隆了AMH的cDNA序列全长,为2324 bp(GenBank登录号:KP718479),其开放阅读框为1631 bp,编码543个氨基酸。同源性分析显示金钱鱼AMH与花鲈相似性最高,为71.16%,与斑马鱼相似性仅为29.83%。系统进化树分析表明,该基因与鲈形目紧密聚为一支,与金钱鱼进化地位一致,说明AMH在进化中有一定保守性。氨基酸结构分析表明其1~28为信号肽序列,69~426为AMH-N区域,444~543为TGF-β结构区。实时荧光定量研究表明,金钱鱼成鱼中AMH基因在精巢中表达量显著高于其他组织,在肝和卵巢中也有表达。性腺不同发育时期分析表明,AMH基因在精巢发育Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期均维持高水平表达,IV期表达水平有所降低,H.E染色结果显示这一时期精巢发育逐渐成熟,推测该基因在精巢发育和精子产生过程中有重要作用。在卵巢中,AMH在Ⅰ、Ⅱ期卵巢发育初期表达量较低,在Ⅲ、Ⅳ期卵母细胞大生长期及卵黄积累期表达量升高,推测其在卵母细胞的发育和功能维持上发挥作用。提示AMH基因在金钱鱼精巢、卵巢发育过程中均发挥重要作用。     

半滑舌鳎生物钟相关基因克隆及在卵巢发育成熟过程中表达特征分析

为阐明生物钟相关基因在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵巢成熟过程中的作用及机制,采集性成熟半滑舌鳎不同发育期的卵巢组织提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对5个核心生物钟基因Clock1a、Bmal1a、Cry1a、Cry2和Per2的编码区(CDS)序列进行克隆和序列分析。结果显示,Clock1a的CDS序列编码712个氨基酸,序列中有功能性结构域PASD1和PAS11。Bmal1a的CDS序列编码626个氨基酸,序列中有功能性结构域PASD3和PAS11。Cry1a和Cry2的CDS序列分别编码631个、669个氨基酸,序列中均有功能性结构域FAD7。Per2的CDS序列编码1 415个氨基酸,序列中有功能性结构域PeriodC和PAS11。通过实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析5个生物钟基因mRNA在性成熟半滑舌鳎卵巢不同发育期的表达特性,发现5个生物钟基因存在性腺发育周年表达规律,且在卵巢Ⅱ期和Ⅲ期相对高表达(P<0.05),在卵巢Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ期相对低表达,这说明生物钟基因对半滑舌鳎的卵巢发育成熟起到重要的调节作用。研究结果为进一步探究生物钟基因调控半滑舌鳎卵巢发育成熟的机制提供了重要参考,为提高半滑舌鳎的繁育效率提供了理论基础。     

吉富罗非鱼 MSTN 基因结构及其多态性与生长性状的相关性

通过PCR和基因组步移法,从吉富罗非鱼DNA中扩增出肌细胞生长抑制素(MSTN)基因及其5′调控区。该序列全长2413bp,含有3个外显子,2个内含子。5′调控区462bp,外显子Ⅰ379bp,外显子Ⅱ371bp,部分外显子Ⅲ145bp,内含子Ⅰ305bp,内含子Ⅱ751bp,编码区共编码298个氨基酸。5′调控区含有与肌肉特异性基因转录密切相关的转录调控元件E-box以及其他一些转录调控元件,如TATAbox,OCT1,AP1,AP4。通过随机测序法寻找SNPs(Signal nucleotide poly morphisms),获得了3个SNPs,但在群体筛选中,只有内含子Ⅱ内的1个SNPs表现多态性。同时测量了96尾(45♂,51♀)吉富罗非鱼的体质量、体长、体高、体厚,并将这些数据与MSTN基因的SNPs多态性进行相关性分析,研究发现MSTN基因内含子Ⅱ的728nt处G/T多态与吉富罗非鱼体型(体厚/体长、体高/体长)存在显著相关(P0.05)。这些研究结果表明,MSTN基因的SNPs可作为吉富罗非鱼育种的候选分子标记。     

中国大鲵Cyp51基因特征与性腺表达分析

采用RT-PCR法从大鲵( Andrias davidianus )性腺中分离获得 Cyp51 基因全长cDNA 1 975 bp, 5′端非编码区135 bp, 3′端非编码区331 bp,开放阅读框( ORF)1 509 bp,编码503氨基酸。生物信息学分析显示, Cyp51 基因编码蛋白的二级结构含有50.20%的α-螺旋,9.96%的延伸链,3.59%的β-转角,36.25%的无规则卷曲。系统进化树显示,大鲵与两栖类中的热带爪蟾和非洲爪蟾同源性最高,与其它物种也有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示, Cyp51 基因在卵巢、肝、肾等组织表达水平显著性高于其它各组织;性腺发育不同时期表达结果显示, Cyp51 基因在1-5Y卵巢中表达显著性高于精巢,在6Y时无显著性差异;在雌性与伪雌性性腺中表达水平显著高于雄性及伪雄性性腺。结果表明 Cyp51 基因对大鲵的性腺分化,尤其是卵巢发育有着重要作用。     

奥利亚罗非鱼雌激素β受体两种亚型cDNA的克隆、组织分布及雌激素对其表达的影响

采用RT-PCR和RACE技术,克隆了奥利亚罗非鱼β雌激素受体基因(estrogen receptorβ,ERβ)两种亚型的cDNA全序列(ERβ1和ERβ2)。荧光定量PCR分析雌雄奥利亚罗非鱼两种亚型的组织分布,并观察注射外源雌激素对雄性奥利亚罗非鱼下丘脑-垂体-性腺轴雌激素受体ERα和β(β1/β2)基因表达的影响。序列分析表明,ERβ1cDNA全长为4262bp,其中包含239bp5′非编码区,2349bp3′非编码区和1674bp的开放阅读框,共编码557个氨基酸。ERβ2 cDNA全长为2506bp,包含5′非编码区393bp,3′非编码区109bp,阅读框为2004bp,共编码667个氨基酸。氨基酸序列同源性分析显示奥利亚罗非鱼ERβ1与尼罗罗非鱼的相似性高达99.1%,而与鲈形目其它鱼类的相似性为82.6%～94.2%。ERβ2氨基酸序列与尼罗罗非鱼的相似性为98.7%,与大口黑鲈、虹鳟、底鳉及斑马鱼的相似性分别为81.8%、76.3%、64.7%和55.0%。在系统进化树上奥利亚罗非鱼的ERβ1和ERβ2分别与尼罗罗非鱼的相应受体聚类。奥利亚罗非鱼ERβ1/β2基因在所检测的10种组织中均有...     

中华鳖NR5a2基因的克隆与表达分析

为了解NR5a2在中华鳖(Pelodiscus sinensis)性腺分化过程中的作用,通过RACE技术克隆获得中华鳖NR5a2 cDNA。结果显示:该基因序列全长为2 674 bp,开放阅读框为1 608 bp,编码535个氨基酸,5′非编码区长度为40 bp,3′非编码区长度为1 026 bp。生物信息学分析表明该基因编码的蛋白质分子质量为60.5 ku,等电点为8.57,具有保守的ZnF-C4结构域和HOLI结构域。氨基酸多重序列比对分析表明中华鳖NR5a2基因与西部锦龟(Chrysemys picta bellii)的相似性最高,其次是原鸡(Gallus gallus)。系统进化分析表明中华鳖NR5a2与西部锦龟的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明NR5a2在中华鳖不同组织中均有表达,且卵巢组织中的表达量显著高于精巢组织。31.5℃孵化条件下,不同发育时期的中华鳖胚胎组织中发现NR5a2基因在17期时表达量达到最高,随后显著下降。结果表明NR5a2可能参与中华鳖的性别分化。     

暗纹东方鲀芳香化酶基因的结构及表达分析

性腺型芳香化酶基因是一种调节雌雄激素平衡的基因。为初步探究暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因的cDNA全长序列,共1786 bp,编码514个氨基酸,与红鳍东方鲀及星点东方鲀同源性最高。氨基酸序列分析显示,该基因编码的蛋白是一种稳定的亲水性蛋白,但不存在信号肽序列;性腺型芳香化酶含有38个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、2个跨膜保守结构域;其氨基酸序列在哺乳动物和鱼类中均十分保守,且含有跨膜区、Ⅰ-螺旋区、Ozol′s肽区、芳香化酶特异性保守区和亚铁血红素结合区等功能保守区。表达分析显示,暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因主要在肌肉和卵巢中表达,其次在其他组织中也有少量表达,而且在幼鱼不同发育期卵巢中的表达量呈现出逐渐升高再降低的表达趋势,在精巢中则基本不表达。研究结果表明,性腺型芳香化酶基因很可能参与了暗纹东方鲀雌鱼性腺分化后卵巢的发育、雌性特征的维持和其他组织的发育等过程。     

半滑舌鳎Shh基因的克隆与表达及甲基化分析

通过RACE方法获得半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Hh基因家族的Shh基因,该基因全长1 922 bp,其中5′UTR 266 bp,3′UTR 360 bp,ORF1 296 bp,编码431个氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为47.28 k D,理论等电点6.95,具有Hh基因家族特有的保守结构域。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Shh与牙鲆的同源性最高,为82%,与其他鱼类同源性为74%~81%,与非洲爪蟾的同源性为61%,与人和鼠的同源性为63%~64%。甲基化结果显示,Shh基因在1龄卵巢中的甲基化程度普遍低于雄鱼与伪雄鱼精巢。基因表达分析显示,Shh基因在胚胎期的囊胚期表达显著高于其它时期(P0.05),在雌雄成鱼8个组织器官均表达,在雌性性腺分化的关键期孵化后50 d,雌性性腺中表达量较前期升高,且显著高于同时期雄性性腺中的表达(P0.05),在雄性性腺分化的关键期80~95 d,Shh基因在雄性中的表达水平显著升高(P0.05),在8月龄、1龄及2龄雌鱼性腺中表达显著高于雄鱼与伪雄鱼。本研究表明,半滑舌鳎Shh基因在进化中高度保守,与胚胎分化、组织器官形成、雌雄性腺分化及性腺发育密切相关。     

青虾Ran基因的克隆、表达及其在卵巢发育中的功能

本研究应用RACE技术克隆了青虾(Macrobrachium nipponensis)Ran(Ras related nuclear protein,Ras相关核蛋白)基因全长cDNA序列,该基因cDNA全长1191 bp,包括218 bp的5'UTR,648 bp的开放阅读框(ORF),405 bp的3'UTR,编码215个氨基酸。青虾Ran基因属于P-loop-NTPase超级家族,拥有PTZ00132跨结构域,多肽分子量约为24.57 kDa,理论等电点7.13。系统进化树分析表明,在动物界进化中非常保守的青虾Ran多肽与罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)聚为一支,具有最近的亲缘关系。使用荧光定量PCR技术检测Ran基因在成体青虾不同组织和卵巢不同发育期的表达差异,结果显示,Ran基因在青虾不同组织中均有表达,其表达量在卵巢中最高,是精巢表达量的7~8倍;随着卵巢的发育,Ran基因的表达水平呈现上升趋势,在卵巢消退期又恢复到较低水平。RNA干扰后,实验组Ran基因表达量显著低于对照组(P0.05),同时卵巢发育关键基因Vg(vitellogenin)在卵巢中的表达量也显著低于对照组(P0.05),推测Ran基因参与雌性卵巢发育过程并对Vg基因的表达起到调控作用。     

文蛤粪卟啉原Ⅲ氧化酶基因克隆及与壳色性状的相关性分析

粪卟啉原Ⅲ氧化酶(coproporphyrinogen-III oxidase,CPOX)是卟啉类化合物合成过程中的关键酶,而卟啉是形成机体色素的重要化合物。采用RACE方法克隆获得文蛤粪卟啉原Ⅲ氧化酶基因(MmCPOX)的cDNA序列,该序列全长1490 bp,其中开放阅读框1173 bp,编码390个氨基酸,预测分子量为12.04 ku,理论等电点为5.05;预测该酶含有跨膜结构域和Coprogen-oxidas结构域;从构建的系统进化树来看,软体动物门的文蛤、加州海兔和太平洋牡蛎首先聚在一起,显示出较近的亲缘关系。qRT-PCR结果显示,MmCPOX基因在文蛤早期发育的各个时期均有表达,但在D形幼虫期以后表达量显著升高;在文蛤成贝的7个组织中,外套膜和血液中表达量显著高于其他组织,表明其与血卟啉合成和壳色卟啉形成相关;在不同壳色文蛤中,红壳文蛤、暗纹文蛤、细纹文蛤的外套膜中表达量显著高于黑斑文蛤和白壳文蛤,表明其参与形成红色和褐色壳色。