中国大鲵Cyp51基因特征与性腺表达分析

采用RT-PCR法从大鲵(Andrias davidianus)性腺中分离获得Cyp51基因全长cDNA 1 975 bp, 5′端非编码区135 bp, 3′端非编码区331 bp,开放阅读框(ORF)1 509 bp,编码503氨基酸。生物信息学分析显示,Cyp51基因编码蛋白的二级结构含有50.20%的α-螺旋,9.96%的延伸链,3.59%的β-转角,36.25%的无规则卷曲。系统进化树显示,大鲵与两栖类中的热带爪蟾和非洲爪蟾同源性最高,与其它物种也有较高的同源性。qRT-PCR分析结果显示,Cyp51基因在卵巢、肝、肾等组织表达水平显著性高于其它各组织;性腺发育不同时期表达结果显示,Cyp51基因在1-5Y卵巢中表达显著性高于精巢,在6Y时无显著性差异;在雌性与伪雌性性腺中表达水平显著高于雄性及伪雄性性腺。结果表明Cyp51基因对大鲵的性腺分化,尤其是卵巢发育有着重要作用。     

黄鳝醛酮还原酶基因的重组表达及多抗制备

为实现原核表达黄鳝醛酮还原酶基因并制备其多克隆抗体,笔者利用基因特异性引物自黄鳝肝脏cDNA中扩增黄鳝醛酮还原酶全长序列,将之克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,构建了重组表达载体;经测序验证后的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后进行IPTG诱导。利用Ni离子亲和柱纯化了重组蛋白,通过多次免疫新西兰兔制备了多克隆抗体;采用Western blot和免疫组化法鉴定兔抗醛酮还原酶多克隆抗体的特异性,用间接ELISA技术检测多抗的效价。结果发现成功构建pET/Eakr原核表达载体,并实现了重组蛋白的融合表达和纯化;Western blot检测表明制备的兔多克隆抗体不仅能特异性地识别来源于黄鳝4种组织的醛酮还原酶蛋白而且还可识别来源于黄颡鱼、团头鲂、乌鳢、鲫鱼和草鱼的同源蛋白。免疫组化结果提示该多抗可特异性识别黄鳝小肠、肝胰组织和脾脏的醛酮还原酶蛋白。制备的多抗效价达1∶6400。     

黄鳝醛酮还原酶对大肠杆菌非生物胁迫耐受性的影响

醛酮还原酶是一类依赖NAD(P) H的氧化还原酶,在生物体内参与了糖代谢、酮代谢和物质运输等多种生理过程。为了解黄鳝醛酮还原酶在细胞逆境胁迫中的保护作用,采用液体培养和斑点展示法,比较含黄鳝醛酮还原酶Eakr的重组菌株和阴性对照菌株在Na Cl、Cu2+和H2O2等非生物胁迫下的存活率和生长活力。结果表明,含重组醛酮还原酶Eakr的大肠杆菌在高渗透压、重金属和氧化胁迫下的生存率显著高于阴性对照,其生存活力也大大增强。提示黄鳝醛酮还原酶Eakr可能参与了细胞活性氧代谢和物质运输等多种生理过程。     

黄鳝肠道假单胞杆菌铁蛋白基因的克隆及融合表达

细菌铁蛋白(bacterioferritin,Bfr)在细菌铁代谢过程中具重要作用。为分析黄鳝肠道假单胞杆菌铁蛋白基因Bfr的功能,以该菌基因组DNA为模板,PCR扩增Bfr基因后将其克隆到pGEX-4T-1表达载体中。序列测定后转化大肠埃希菌BL21(DE3),经IPTG诱导、GST-resin纯化柱分离纯化获得Bfr蛋白。用SDS-PAGE电泳及Western blot检测融合蛋白;用比色法检测融合蛋白的铁离子螯合能力,用液体培养法分析重组蛋白对假单胞杆菌生长的影响。实验结果表明:成功获得黄鳝肠道假单胞杆菌Bfr基因,并实现了Bfr基因的融合表达;带有融合标签的GST-Bfr蛋白与Fe³⁺和Fe²⁺均不能结合,而Bfr蛋白则可以结合Fe³⁺但不能结合Fe²⁺;在外源添加Fe³⁺情况下,重组Bfr蛋白可促进假单胞杆菌的营养生长。该研究为进一步深入了解假单胞杆菌铁蛋白基因的功能提供了参考资料。