半滑舌鳎新型膜孕激素受体基因分子特征及其在卵巢发育过程的作用

为进一步提高半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)人工育苗技术水平,对半滑舌鳎新型膜孕激素受体(m PR-like)基因进行研究。采用同源克隆和末端快速扩增(RACE)方法,获得全长为2 002 bp的半滑舌鳎新型膜孕激素受体的c DNA序列;二级结构分析表明,该蛋白存在7个跨膜区域;三级结构分析表明该蛋白有多个结合位点。使用MEGA4.0临位相联法和Clustal X方法对m PR-like的氨基酸序列进行聚类分析和序列相似度分析,发现半滑舌鳎m PR-like与青鳉(Oryzias latipes)和三刺鱼(Gasterosteus aculeayus)的m PR-like聚为一支,相似度分别为68%和72%。应用实时定量PCR方法分析了m PR-like m RNA表达情况,发现m PR-like m RNA在性成熟雌性半滑舌鳎不同组织表达具有广泛性,但表达量存在差异,在脑、卵巢、心脏、鳃、脾和胃等组织表达丰富;在不同发育阶段卵母细胞中,m PR-like m RNA表达水平从II时相卵母细胞到V时相卵母细胞持续升高,而在VI时相卵母细胞的表达水平显著下降(P0.05);在半滑舌鳎繁殖周期的脑和卵巢组织中,m PR-like m RNA的表达水平从性腺发育II期到V期持续升高,并且在V期达到最高峰(P0.05),VI期表达量开始下降;在半滑舌鳎繁殖周期的垂体组织中,不同繁殖期m PR-like m RNA表达水平变化幅度不大,但在性腺发育V期时垂体中的表达量显著高于其他繁殖期(P0.05)。放射免疫测定的结果表明,半滑舌鳎雌鱼血清中孕酮激素的含量变化在整个繁殖周期中差异显著(P0.05),在性腺发育IV期含量迅速升高并在V期达到峰值。该基因在半滑舌鳎多种组织中的表达特征,预示其具有多种生理学作用;在卵母细胞和繁殖周期脑–垂体–卵巢的表达特征表明其参与卵母细胞成熟过程和生殖调控。     

池塘养殖条件下牙鲆(Paralichthys olivaceus)甲状腺轴和生长轴关键激素的变化规律

通过统计学、酶联免疫学等方法研究3个池塘中养殖牙鲆(Paralichthys olivaceus)的生长状况、血清四碘甲状腺素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)、生长激素(GH)、类胰岛素生长因子-I(IGF-Ⅰ)和温度的周年变化规律。结果显示,在365 d的养殖过程中,3个池塘牙鲆体重和体长持续增长且体重日增长率和体长日增长率在温度较高的夏末秋初出现较高值。3个池塘牙鲆血清中T3、T4含量变化整体趋势一致,血清T4浓度在夏末出现最高值,T3浓度在秋初出现最高值,滞后于T4。IGF-I水平最高值出现在温度较高的夏末、秋初滞后于GH最高值夏初。牙鲆血清中T3、T4、GH和IGF-I 4种激素含量变化和生长率变化规律大体一致,呈现明显的周年变化规律。     

膜孕激素受体(mPRα)在半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)卵母细胞成熟过程中的表达特征

通过实时荧光定量PCR方法(qRT-PCR)检测半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)雌性性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,通过qRT-PCR和Western blotting方法检测促性腺激素(HCG)对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响,同时,采用原位杂交、免疫组化和Western blotting方法研究雌性性成熟半滑舌鳎mPRα mRNA和蛋白在各组织中的表达.对半滑舌鳎性成熟不同时期、不同时相卵母细胞中mPRα mRNA的定量研究结果显示,在成熟时期半滑舌鳎Ⅴ时相卵母细胞的mPRα mRNA表达量最高.HCG对成熟期半滑舌鳎卵母细胞mPRα表达的影响研究结果显示,20 IU/ml HCG比10 IU/ml HCG对成熟时期半滑舌鳎卵母细胞mPRα mRNA和蛋白表达的促进作用更明显,进一步证明mPRα介导孕激素参与了卵母细胞成熟的调控.对mPRα组织表达的定量和定位研究中,Western blotting结果显示,在半滑舌鳎的卵巢、垂体、脑、头肾、肾、肝脏组织中均有mPRα蛋白表达,且在脑、垂体和卵巢中表达量较高,表明mPRα在不同组织中都发挥着一定的作用,且在内分泌相关组织如脑、垂体和卵巢中的作用更明显.原位杂交和免疫组化结果显示,mPRα mRNA和蛋白表达明显定位在卵母细胞膜上,且在其他组织的外周和管腔结构表达.本研究为进一步研究mPRα在膜上的信号转导机制提供了理论基础和形态学依据.     

mPRα在性成熟雌性牙鲆(Paralichthys olivaceus)不同组织中的定性定量表达特征

通过荧光实时定量PCR方法(qRT-PCR)检测雌性性成熟牙鲆(Paralichthys olivaceus)第Ⅴ时期不同时相的卵母细胞中膜孕激素受体(mPRα)的表达,同时采用原位杂交、免疫组化和Western blotting方法研究性成熟雌性牙鲆mPRα mRNA和蛋白在各组织中的分布和表达.qRT-PCR结果显示,在牙鲆卵巢成熟时期的第Ⅴ时相卵母细胞,mPRα mRNA的表达量最高,表明mPRα介导孕激素参与了牙鲆卵母细胞成熟的调控.组织定量定位结果显示,在牙鲆的卵巢、脑、头肾、肾、肝脏组织中均有mPRα mRNA和蛋白表达存在,且在脑、卵巢中表达量较高,表明mPRα在牙鲆不同组织中都发挥着一定的作用,且在内分泌相关组织如脑和卵巢中的作用更明显.原位杂交和免疫组化结果显示,mPRα mRNA和蛋白表达明显定位在牙鲆卵母细胞膜上,且分布在其他组织的管腔结构.本研究为进一步探究牙鲆mPRα信号转导机制提供了理论基础和形态学依据.