半滑舌鳎Shh基因的克隆与表达及甲基化分析

通过RACE方法获得半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)Hh基因家族的Shh基因,该基因全长1 922 bp,其中5′UTR 266 bp,3′UTR 360 bp,ORF1 296 bp,编码431个氨基酸,经预测该多肽的相对分子质量为47.28 k D,理论等电点6.95,具有Hh基因家族特有的保守结构域。氨基酸序列分析表明,半滑舌鳎Shh与牙鲆的同源性最高,为82%,与其他鱼类同源性为74%~81%,与非洲爪蟾的同源性为61%,与人和鼠的同源性为63%~64%。甲基化结果显示,Shh基因在1龄卵巢中的甲基化程度普遍低于雄鱼与伪雄鱼精巢。基因表达分析显示,Shh基因在胚胎期的囊胚期表达显著高于其它时期(P0.05),在雌雄成鱼8个组织器官均表达,在雌性性腺分化的关键期孵化后50 d,雌性性腺中表达量较前期升高,且显著高于同时期雄性性腺中的表达(P0.05),在雄性性腺分化的关键期80~95 d,Shh基因在雄性中的表达水平显著升高(P0.05),在8月龄、1龄及2龄雌鱼性腺中表达显著高于雄鱼与伪雄鱼。本研究表明,半滑舌鳎Shh基因在进化中高度保守,与胚胎分化、组织器官形成、雌雄性腺分化及性腺发育密切相关。     

黄鳝细胞质动力蛋白3基因的克隆及其在性逆转中的功能分析

为解析黄鳝(Monopterus albus)性逆转机制，实验以雌、雄、间性发育黄鳝为研究对象，分析不同组织、不同发育时期性腺、甲基睾丸酮处理性腺及Zebularine处理性腺原代细胞后dynlt3基因表达模式的变化及其在性腺中的表达定位。性腺转录组测序结果显示，基因全长1 082 bp,开放阅读框354 bp,编码117个氨基酸。生物信息学分析显示，dynlt3基因编码蛋白质的二级结构包含37.96%的α-螺旋，29.20%的β-折叠，32.85%的无规则卷曲。系统进化分析结果显示，黄鳝DYNLT3氨基酸序列与硬骨鱼纲中底鳉(Fundulus heteroclitus)同源性最高。实时荧光定量PCR结果表明，dynlt3基因在黄鳝肌肉和脑具有较高表达，心脏次之，在其它各组织表达量较低。在性腺的不同发育时期，在间性后期和雄性中表达量显著性高于雌性与间性早期。甲基睾酮处理后黄鳝卵巢组织结构发生明显退化，卵母细胞退化且数量减少，结缔组织间出现空泡结构；dynlt3基因在卵巢中表达量显著性下调。原位杂交分析dynlt3基因在性腺组织中的表达定位结果显示，在不同性腺发育时期均检测到dynlt3...     

中国大鲵生长激素受体的克隆与表达分析

利用中国大鲵(Andrias davidianus)性腺转录组测序获得的生长激素受体(GHR)基因部分序列,克隆获得基因全长2992 bp,开放阅读框1812 bp,编码604个氨基酸,该蛋白具有高度保守的FGEFS基序与BOX框。系统进化分析结果显示,中国大鲵GHR氨基酸序列与两栖类非洲爪蟾(Xenopus laevis)同源性最高,蜥形纲锦龟(Chrysemys picta bellii)次之,哺乳类水牛(Bubalus bubalis)和鱼类半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis))最低。实时定量PCR结果表明,GHR基因在肝中表达最高,肌肉、垂体、肾、性腺中的表达量次之,其他各组织表达量较低。在精巢发育早期GHR表达较高,随后表达量逐渐降低,在卵巢中表达量随时间增长而增加;17α-甲基睾丸酮(MT)与芳香化酶抑制剂来曲唑(LE)短暂处理后GHR基因在脑与卵巢中表达量发生变化,MT处理后,脑与卵巢中GHR表达量增加,LE处理后脑与卵巢中表达量降低。研究表明,GHR基因在大鲵性腺发育中可能发挥作用,且MT与LE可能通过不同的途径调节GHR基因的表达。     

胡子鲇脑型芳香化酶基因全长cDNA克隆及表达

采用RT-PCR和RACE法,克隆了胡子鲇(Clarias fuscus)脑型芳香化酶基因Cyp19a1b,应用荧光实时定量PCR检测其在前脑、下丘脑、脑垂体、肝、精巢和卵巢6种组织,以及性腺分化前后(出膜后12～30 d)全鱼中的mRNA表达。结果表明,Cyp19a1b cDNA全长2 347 bp,5′端非编码区219 bp,3′端[不包括poly(A)]596 bp,开放阅读框(ORF)1 503 bp,编码500个氨基酸,推测其编码蛋白质分子量为56.388 kD。序列分析及分子系统进化树结果表明,胡子鲇Cyp19a1b氨基酸序列与非洲鲇(Clarias gariepinus)Cyp19a1b同源性最高,达95.6%;与南方大口鲇(Silurusmeridionalis)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、斑马鱼(Danio rerio)、斑点叉尾(Ictalurus punctatus)、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)、鲤(Cyprinus carpio)、鲫(Carassius auratus)及稀有鲫(Gobiocypris rarus)Cyp19a1b同源性达75%以上,但与上述鱼类的性腺型芳香化酶基因(Cyp19a1a)同源性低于62%,表明其为脑型芳香化酶,同源性分析结果与根据传统形态学和生化特征分类的结果相一致。荧光实时定量PCR结果显示,Cyp19a1b在胡子鲇上述组织中均有表达,其中下丘脑中表达量最高,肝和精巢最低,在脑部的表达存在明显的性别差异(P<0.05)。此外,在胡子鲇性腺分化前(出膜后12 d)Cyp19a1b即开始表达,但分化前后表达量无显著性差异(P>0.05)。结果暗示Cyp19a1b可能不是引起胡子鲇性腺分化的直接因素,但其可能通过"下丘脑垂体性腺轴"对性腺分化过程产生间接影响。     

大黄鱼sox9a/b基因的克隆与表达分析

为探究sox9基因在大黄鱼性别决定与分化过程中的作用,利用RACE方法克隆得到大黄鱼sox9a和sox9b 2个基因,采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)分析其在雌雄个体不同组织和不同发育阶段的表达规律,并检测了其在17β-雌二醇处理后的遗传雄性和17α-甲基睾酮诱导处理后遗传雌性幼鱼中的表达变化。结果显示,大黄鱼sox9a c DNA全长2 442 bp(NCBI登录号:MH996431),包含476 bp 5′UTR、466 bp 3′UTR、1 500 bp ORF,编码499个氨基酸。大黄鱼sox9b cDNA全长为2 199 bp (NCBI登录号:MH996432),包含335 bp5′UTR、415 bp 3′UTR、1 449 bp ORF,编码482个氨基酸。qRT-PCR分析显示,sox9a基因主要在性腺、眼、脑、肝脏中表达,精巢中的表达量显著高于卵巢;sox9b在大黄鱼各组织中广泛表达,但以精巢中表达量最高,而卵巢中只有痕量表达。在鱼苗性腺发育初期,sox9a/b的表达量都维持在较低水平;随着鱼苗长大,sox9a/b的表达量在84 dph、123 dph 2次达到高峰,随后开始下降,10 mph后又逐渐上升。17β-雌二醇处理能够显著下调遗传雄性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达,17α-甲基睾酮处理则显著上调遗传雌性大黄鱼sox9a和sox9b基因在性腺中的表达。研究表明,sox9a/b基因与大黄鱼性别发育和分化过程密切相关,对大黄鱼精巢的发育与维持起重要的调控作用,而且两个基因的功能可能具有一定程度的分化。     

斑节对虾细胞周期蛋白Y基因克隆与原核表达

为了研究细胞周期蛋白Y(cyclin Y)在斑节对虾(Penaeus monodon)卵巢发育中的作用,从斑节对虾转录组数据中筛选获得cyclin Y基因部分序列,采用SMART-RACE方法克隆得到斑节对虾细胞周期蛋白Y(Pm-cyclin Y)基因c DNA全序列。Pm-cyclin Y基因c DNA全长1576 bp,其中包含108 bp的5′非编码区(5′UTR)和439 bp的3′非编码区(3′UTR)以及1029 bp的开放阅读框(ORF),可编码342个氨基酸。生物信息学分析显示,其编码的氨基酸序列有1个保守的周期蛋白框(cyclin box)同源结构域(172~257 aa),预测的分子量约为37.6 k D,理论等电点6.64。实时定量PCR显示其m RNA在卵巢的表达量显著高于其他组织(P0.05);并且在卵巢5个不同发育期都有表达,在III期卵巢中的表达量最高。本研究通过原核表达方法对Pm-cyclin Y进行重组表达,为其蛋白质功能方面的研究奠定了基础。     

暗纹东方鲀芳香化酶基因的结构及表达分析

性腺型芳香化酶基因是一种调节雌雄激素平衡的基因。为初步探究暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因在性腺发育和性别分化过程中的作用,通过RACE及荧光定量PCR技术,成功克隆出暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因的cDNA全长序列,共1786 bp,编码514个氨基酸,与红鳍东方鲀及星点东方鲀同源性最高。氨基酸序列分析显示,该基因编码的蛋白是一种稳定的亲水性蛋白,但不存在信号肽序列;性腺型芳香化酶含有38个磷酸化位点、4个N-糖基化位点、2个跨膜保守结构域;其氨基酸序列在哺乳动物和鱼类中均十分保守,且含有跨膜区、Ⅰ-螺旋区、Ozol′s肽区、芳香化酶特异性保守区和亚铁血红素结合区等功能保守区。表达分析显示,暗纹东方鲀性腺型芳香化酶基因主要在肌肉和卵巢中表达,其次在其他组织中也有少量表达,而且在幼鱼不同发育期卵巢中的表达量呈现出逐渐升高再降低的表达趋势,在精巢中则基本不表达。研究结果表明,性腺型芳香化酶基因很可能参与了暗纹东方鲀雌鱼性腺分化后卵巢的发育、雌性特征的维持和其他组织的发育等过程。     

大鲵Dmrt2基因cDNA的克隆与表达分析

Dmrt2是参与性腺发育最古老的发育基因家族Dmrt家族成员之一,在维持胚胎组织的正常发育、精子的发生、神经系统和感觉器官发育等方面起重要作用。目前在哺乳动物人类、鸟类红原鸡以及水生动物青鳉中都克隆到Dmrt家族成员并证明其与性腺和生长发育的密切相关性。研究采用RACE方法克隆了大鲵Dmrt2基因全长cDNA序列共2 026 bp,开放阅读框长1 581 bp,5′非编码区长58 bp,3′非编码区长387 bp,基因序列提交GenBank的登录号为FJ859987。该基因编码蛋白含526个氨基酸,依生物信息学方法预测该氨基酸为非跨膜蛋白,无信号肽,定位在细胞质内,无分泌蛋白。CDD数据库分析该ORF框翻译的氨基酸,在93~146位含DM保守结构域(c102557)的两个成员pfam00751和smart003010,与哺乳类人mab-3、鸟类红原鸡Dmrt2、两栖类非洲爪蟾Dmrt2和水生类鲐mab-3 DM结构域存在I(异亮氨酸)、R(精氨酸)、M(甲硫氨酸)、T(苏氨酸)、C(半胱氨酸)5个氨基酸的变异;系统进化树分析表明:大鲵Dmrt2与以上四物种首先聚类,据此推测Dmrt基因在进化上高度保守,DM结构域上5个氨基酸的变异对蛋白功能的发挥可能无重要影响。实时荧光定量组织差异表达显示,Dmrt2基因在大鲵的精巢和肌肉组织中高表达,预示该基因可能在性腺发育和生长发育方面起重要作用。     

半滑舌鳎StAR基因克隆及其在不同组织的时空表达分析

利用半滑舌鳎性腺转录组测序获得的StAR基因部分序列,设计RACE引物,克隆了半滑舌鳎StAR基因的cDNA序列,全长为1 294 bp,5'端UTR为132 bp,3'端UTR为310 bp,开放阅读框(ORF)为852 bp,共编码283个氨基酸。将半滑舌鳎StAR基因与其他物种StAR基因进行氨基酸同源性分析,结果显示,半滑舌鳎StAR与塞内加尔鳎、大口黑鲈、花鲈、金头鲷的同源性都达到了85%,与虹鳟、斜带石斑鱼及日本鳗鲡的同源性分别为81%、83%和76%。雌、雄鱼不同组织StAR基因的表达分析表明,StAR基因在雄鱼性腺中高表达,在雄鱼的肝脏、脑及心脏中表达量较低,而在雄鱼的其他组织中不表达;在雌鱼肠中不表达,在其他组织(卵巢、肝脏、脾脏、脑、垂体、肌肉、心脏、肾脏)中微量表达。荧光定量PCR分析不同组织与不同时期性腺表达谱表明,雄鱼性腺中StAR基因的表达量显著高于雌、雄鱼其他各组织(P0.05),提示StAR基因对雄鱼精巢发育起重要作用。雄鱼不同时期表达谱分析结果显示,StAR基因在66天前的精巢中不表达,在150天时表达量急剧增加,至2龄时表达量最高,3龄时表达量下降,说明该基因在精巢发育成熟过程中起重要作用。原位杂交结果显示,StAR基因主要在雄鱼精巢的精子细胞中表达,而在雌鱼的卵巢中不表达。研究表明,StAR基因在半滑舌鳎精巢发育中发挥作用,且可能在精子形成中发挥重要作用。     

半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段的克隆与表达分析

同源克隆了半滑舌鳎Dmrt3基因的部分cDNA片段,片段长度为228 bp,NJ系统发育树显示,半滑舌鳎Dmrt3基因cDNA片段与红鳍东方鲀、青鳉以及斑马鱼的Dmrt3基因cDNA片段同源性最高,首先聚为一支。实时定量分析了Dmrt3基因在半滑舌鳎雌性和雄性个体的各组织中的表达情况,以及在高温处理和甲基睾酮处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织中的表达。Dmrt3基因在雌性和雄性的脑、垂体、性腺、肝脏、脾脏、心脏、肾脏7个组织中都有表达,但是表达量有差异,在精巢中的相对表达量高,Dmrt3基因在精巢的表达与其它组织中的表达差异极显著(P<0.01),而在卵巢中的表达很微弱,结果预示Dmrt3基因可能在雄性的性腺发育过程中起着重要的作用。高温处理组的雌性、雄性和伪雄鱼的性腺组织之间Dmrt3的表达无显著差异(P>0.05),但都极显著低于对照组的雄鱼(P<0.01)。高温处理组的伪雄鱼与对照组雌鱼性腺中Dmrt3的表达表达无显著差异(P>0.05)。甲基睾酮处理组的雄鱼和伪雄鱼性腺中Dmrt3的表达都显著高于对照组雄性(P<0.01)。从孵化后43 d到5月龄,Dmrt3的相对表达量很低,7月龄时表达量显著升高,9月龄时达到最高峰,12月龄时表达量下降,这也预示Dmrt3基因在半滑舌鳎性腺的发育过程中起重要作用,可能是促进生殖细胞发育的重要转录因子。