鸡H-FABP基因外显子2的PCR-SSCP分析

实验选用4个地方品种:清远麻鸡、惠阳三黄胡须鸡、封开杏花鸡、广西霞烟鸡以及3个近年培育的品系:岭南黄快大Ⅱ号配套系、矮小鸡E4专门化品系、AA配套系为材料(每个品种或品系各取5个个体,共35个个体)。采用PCR-SSCP结合DNA测序技术,对H-FABP(心脏型脂肪酸结合蛋白)基因第2外显子区进行了单核苷酸多态性(SNP)分析。结果表明:在第一内含子区含有丰富的SNP位点:580 bp(T→G)、595 bp(A→C)、610 bp(C→-)、617 bp(A→G)、622 bp(A→T)、625 bp(A→-)、627 bp(A→C)、629 bp(A→C)、631 bp(A→C)、677 bp(G→A)和1个双碱基突变586~587 bp(TG→CA);在第二外显子区发现了一个非SNP位点785 bp(C→T);这表明在外显子2上本实验所选品种的序列之间没有差异,但与GenBank上登录号为AY648562的序列相比存在变异。此外在第二内含子区也发现了一个非SNP位点:1018 bp(C→T)。这为进一步分析H-FABP基因的遗传变异及其与肉质性状的相关性以及将该分子标记应用于育种计划奠定一定的理论基础。     

动物性中药材地龙DNA条形码初步研究

利用通用引物对中药材地龙的COI、16S rDNA片断进行PCR扩增、测序、分析,并构建系统进化树,将获得的中药材地龙CO Ⅰ、16S rDNA片断序列提交到GenBank中的DNA Barcoding数据库进行分析.结果显示:(1) 中 药材地龙CO Ⅰ片断的长度为682 bp.其中变异位点(SNP多态位点)有179个,多态位点约占片断总长的26％.碱基A+T的含量为58.8％、G+C的含量为41.2％.16S rDNA片断的长度为503 bp.其中变异位点有70个,多态位点约占片断总长的14％,碱基A+T的含量为62.4％、G+C的含量为37.6％;(2)获得CO Ⅰ序列的登录号为HQ405769-HQ405776,16s rDNA序列的登录号为HQ405777 -HQ405783;(3)中药材地龙DNA中CO Ⅰ序列的基因多态性比16S rDNA序列更显著,适合做为中药材地龙的DNA条形码.     

广西三黄鸡脂蛋白脂酶基因的克隆及蛋白构象分析

【目的】对广西三黄鸡和爱拔益加（AA）鸡的脂蛋白脂酶基因（LPL）进行克隆与蛋白质结构分析,为后期开展LPL基因表达与鸡肌内脂肪含量相关性研究及筛选出与优质肉质相关的分子遗传标记奠定基础。【方法】根据GenBank已公布的鸡“也基因序列设计引物,利用RT-PCR扩增广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因cDNA序列,经双酶切鉴定和序列测定比对分析后,应用生物软件进行蛋白质二级结构预测分析。【结果】成功获得广西三黄鸡和AA鸡的LPL基因编码区序列（CDs）,大小均为1473bp,两者的同源性为99．4％;将广西三黄鸡LPL基因序列提交至GenBank获得序列号JX090309。相对于AA鸡,广西三黄鸡LPL基因CDs存在9个位点的碱基突变,其中碱基^503T→C导致氨基酸^168Val→Ala,^606T→G导致^202Asp→Glu,^1066A→G导致^366Thr→Ala,^1277C→T导致^426Ser→Phe,^1420A→G导致^474Arp→Gly,^1432G→A导致^202Glu→Lys,这6个位点为错义突变;第166、372和1305位点的碱基突变为同义突变。蛋白质二级结构预测结果表明,广西三黄鸡与AA鸡LPL的C端结构域存在空间构象差异。【结论】LPL基因突变引起的氨基酸组成变化及蛋白质二级构象改变,可能影响鸡肌内脂肪沉积,进而决定肉质的优劣,即LPL基因可作为研究广西三黄鸡肌内脂肪代谢的主要候选基因。     

阿勒泰羊与新疆细毛羊ASIP基因多态性与被毛颜色的相关性

利用PCR-SSCP方法检测了阿勒泰羊和新疆细毛羊ASIP基因的多态性位点,并分析各SNPs位点与被毛毛色之间的关系。结果表明,阿勒泰羊ASIP基因外显子2(g.100~104 bp)存在5碱基丢失(D5:AGGAA),外显子4(g.5172 bp:T→A)存在非同义性突变(Ser→Cys);新疆细毛羊中只发现ASIP基因外显子2(g.100~104 bp)存在5碱基丢失(D5:AGGAA);阿勒泰羊ASIP基因2处SNPs与被毛毛色不相关(P0.05),而新疆细毛羊ASIP基因5碱基丢失与被毛毛色极显著相关(P0.01)。     

德保矮马生长激素基因的克隆与序列分析

克隆和分析德保矮马的生长激素(GH)基因全序列.阳性重组质粒测序表明:德保矮马GH基因碱基序列全长1 922 bp(GenBank登录号为EU939447),包含完整的5个外显子和4个内含子.与纯血马比较,有19个碱基位点突变,其中11个位于外显子区域,有义突变4个,第924位碱基C→T致使第70位氨基酸由Thr→Ile,第1 249位碱基C→T使第112位氨基酸Pro→Leu,第1 287位碱基A→T使第125位氨基酸Ser→Cvs,第1 309位碱基A→C使第132位氨基酸Asp→Ala.以GH编码区构建物种的亲缘进化树,GH基因在进化中比较保守.     

长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COⅡ基因PCR及序列分析

为了揭示长白山区中华蜜蜂种型的分子特点,选取其线粒体DNA(mtDNA)非编码区至COⅡ基因段的序列为研究时象,设计并合成了一种理想的用于扩增中华蜜蜂mtDNA非编码区至COⅡ基因段的引物对E2'/H2'.结果可以获得418bp有效的核酸序列;该序列上A+T含量占84.45%,而G+C的含量只有15.55%,序列里长白山区中华蜜蜂与意大利蜜蜂在核苷酸水平上的种间序列相似性为81.71%,并且序列具有丰富的限制性核酸内切酶的酶切位点,其中,52位上的MseI的酶切位点属于长白山区中华蜜蜂的特异酶切位点,53位处出现一个SNP位点,属于由碱基C转换为碱基T的转换型突变,这也进一步证明了蜜蜂mtDNA非编码区是进化速度较快的区域.长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COⅡ基因段序列结果已经获得美国国家生物信息(NCBI)网站GenBank的登录号,登录号为FJ494922.     

几种钝绥螨ITS基因片段的序列分析

 【目的】通过分析比较钝绥螨ITS基因片段,探讨其作为分子手段应用于种类鉴定,同时应用此分子标记来分析钝绥螨的亲缘关系,为研究其系统发育和完善分类系统提供参考。【方法】对采自江西桔园的尼氏真绥螨、江原钝绥螨、津川钝绥螨和东方钝绥螨进行总DNA提取,PCR扩增,测序,并从GenBank中下载5种钝绥螨的ITS序列,应用软件分析ITS片段长度、A+T%含量、变异位点和进化关系。【结果】得到总长度为644—655 bp的ITS序列片段,序列中A+T碱基比例较高,为58.2%。整个ITS基因片段存在204个碱基变异位点（ITS1：172;ITS2：22;5.8S：10）和32个碱基插入/缺失。真绥螨属的尼氏真绥螨和卵圆真绥螨的分类地位较近,遗传距离为0.013;而小新绥螨属的4个种与钝绥螨属的3个种在构建系统发育树时未能明显地分为2支,其中胡瓜新小绥螨和东方钝绥螨的遗传距离最近,为0.083。【结论】ITS序列片段分析结果支持尼氏真绥螨和卵圆真绥螨现在的分类地位,而小新绥螨属与钝绥螨属似乎未达到属间差异,其分类地位有待进一步确定。     

绵羊脂肪型脂肪酸结合蛋白基因(A-FABP)的变异研究

【目的】明确绵羊A-FABP(adipocyte fatty-acid binding protein,A-FABP)基因的变异和单倍型特征.【方法】基于Ensemble数据库中绵羊A-FABP基因全序列,对7个绵羊品种共20个样本的A-FABP基因全序列进行测序分析.【结果】PCR扩增获得绵羊A-FABP基因全长6474bp,A、T、G、C 4种碱基的比例分别为31.48%、33.02%、17.21%和18.29%,A+T平均含量为64.50%,G+C平均含量为35.50%;共发现48处单碱基变异位点和2处微卫星位点M1((TG)n)和M2((TA)n),单一变异位点、2核苷酸变异位点和3核苷酸变异位点比例分别为28.85%、40.4%和0.02%;共发现转换、颠换、插入和缺失4种变异类型,其占变异位点总数的比例分别为45.83%、31.25%、2.08%及20.83%;共发现19种单倍型,单倍型多样度为0.995.【结论】A-FABP基因19个单倍型序列的NJ树分化为2个聚类簇,表明A-FABP基因单倍型最初由2个主要单倍型衍化形成.     

基于线粒体DNA COⅠ~COⅡ分析云南省东方蜜蜂遗传多样性

为探讨云南省东方蜜蜂的遗传多样性,本研究以线粒体DNA COⅠ~COⅡ区间基因片段为指标,利用生物信息学软件分析了云南省6个采样点共179群东方蜜蜂的遗传多样性。结果显示:(1)所得线粒体DNA片段的碱基长度为760 bp,碱基组成为:A为40.4%,T为42.4%,C为10.7%,G为6.5%,表现出A+T偏倚性;(2)共发现28个变异位点,其中,简约信息位点18个,单一多态位点10个;(3)定义了29种单倍型,单倍型多样度和核苷酸多样度分别为0.884和0.002 69;(4)聚类分析结果显示云南省东方蜜蜂无明显遗传分化现象,与国内重庆、甘肃、北京等地亲缘关系较近,与台湾地区亲缘关系较远;与国外的韩国、日本亲缘关系较近,而与马来西亚等地的亲缘关系较远。     

长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因PCR及序列分析

为了揭示长白山区中华蜜蜂种型的分子特点,选取其线粒体DNA(mtDNA)非编码区至COII基因段的序列为研究对象,设计并合成了一种理想的用于扩增中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因段的引物对E2’/H2’,结果可以获得418bp有效的核酸序列;该序列上A+T含量占84.45%,而G+C的含量只有15.55%,序列里长白山区中华蜜蜂与意大利蜜蜂在核苷酸水平上的种间序列相似性为81.71%,并且序列具有丰富的限制性核酸内切酶的酶切位点,其中,52位上的MseI的酶切位点属于长白山区中华蜜蜂的特异酶切位点,53位处出现一个SNP位点,属于由碱基C转换为碱基T的转换型突变,这也进一步证明了蜜蜂mtDNA非编码区是进化速度较快的区域。长白山区中华蜜蜂mtDNA非编码区至COII基因段序列结果已经获得美国国家生物信息(NCBI)网站GenBank的登录号,登录号为FJ494922。     

暗纹东方鲀leptin基因的克隆、SNP筛选及其与生长性状的关联分析

为明确暗纹东方鲀Takifugu obscurus瘦素(Leptin)基因的基本性质,并探究leptin基因的多态性及其与暗纹东方鲀生长的相关性,随机选择6尾健康的3月龄暗纹东方鲀幼鱼作为基因克隆的试验样本,采用RT-PCR方法克隆leptin基因的cDNA序列,随机选择同期繁殖、同塘养殖的178尾8月龄鱼,采用直接测序法筛选leptin基因中与生长相关的SNP位点。结果表明:克隆得到的leptin cDNA序列长为661 bp,包括459 bp的开放阅读框,共编码152个氨基酸,Leptin氨基酸序列含19个氨基酸的信号肽序列,推测该蛋白为亲水的稳定蛋白;暗纹东方鲀Leptin氨基酸序列与红鳍东方鲀Leptin氨基酸序列一致性最高,为96.7%,与不同种属的其他鱼类相似性较低,与草鱼氨基酸序列的一致性仅为25.25%,但不同物种的Leptin存在较高的三级结构相似性;在暗纹东方鲀leptin基因上筛选得到2个分型稳定的SNP位点(T24G、T193A),其中,T24G位点不同基因型个体间的体质量存在显著性差异(P<0.05),GG基因型个体体质量显著小于TG和TT基因型(P<0.05);将2个SNP位点的不同基因型进行组合,经关联分析获得优势双倍型D5,D5型个体的3个生长性状值最高,体质量显著高于D2、D4型个体(P<0.05),极显著高于D6型个体(P<0.01),体长和体全长显著高于D6型个体(P<0.05)。研究表明,T24G位点的TG和TT基因型及双倍型D5是暗纹东方鲀优势生长的基因型,可作为暗纹东方鲀辅助育种的候选分子标记。     

FPV 4b核心蛋白基因的克隆及其探针制备

利用PCR方法成功克隆了FPV 4b核心蛋白基因1 361 bp片段。序列分析表明:该序列与模板DNA(AF198100)的碱基序列同源性为99.5%,只有7个碱基差异(第215位C→A,第386位T→A,第388位G→A,第1 014位T→G,第1 034位T→G,第1 137位C→T,第1 143位A→G)。回收FPV 4b核心蛋白基因1 361 bp片段与pMD18-T载体相连构建重组质粒pMD18-T-4b,用EcoRⅠ酶切pMD18-T-4b后得到1个约360 bp大小的DNA片段,以其为模板制备了地高辛标记的DNA探针。对新标记的探针进行标记效率检测,结果显示其标记效率为100 mg/L。敏感性检测表明,该探针对同源DNA的检出限量为10 pg。特异性检测结果表明,用本试验所标记的探针对提取的FPV 282E4和FPV JL株DNA、重组质粒pMD 18-T-4b进行检测结果均呈阳性,而鸡马立克氏病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、CEF的核酸提取物均呈阴性,说明该探针具有较强的特异性。     

桑属IIS、trnL-F、rps16序列与进化分析

[目的]分析桑属ITS、trnL-F、rps16序列,探讨系统学价值.[方法]67份桑资源,经DNA提取、PCR扩增、测序,测序结果用软件拼接、比对,并从GenBank下载桑属ITS、trnL-F、rps16序列进行同源性分析,计算其长度、G+C(或A+T)含量、变异位点、信息位点,将3个序列合并,以构树、柘树为外类群,采用MP法分析进化关系.[结果]桑ITS(包括5.8S)基本序列长度为576 bp,变异范围为576-590 bp,G+C含量为59.55%--62.25%,40个信息位点;trnL-F(包括tRNA-Leu内含子)基本序列长度为923 bp,变异范围为920-924 bp,A+T含量为65.87%-66.31%,23个信息位点;rps16内含子基本序列长度为929 bp,变异范围为923-929 bp,A+T含量为67.28%-67.49%,17个信息位点.3个序列的最适碱基进化模型分别为(GTR+G)、(GTR)和(GTR+G),可能的分支概率-混合卡方概率值分别为0.000001、0.027175和0.000222,3个片段合并最适碱基进化模型为(GTR+G),基于模型用MP法分析,在2 538个位点中,有80个信息位点.分支图结果表明,首先将黑桑(M.nigra)分出,其它桑种分成2支,第一支包括长穗桑、瑞穗桑、蒙桑、鬼桑、鸡桑、山桑、白桑和广东桑,第二支包括华桑、奶桑和川桑.[结论]桑属traL-F和rps16序列信,息位点有限,单独研究桑属系统学,价值不大,与ITS序列合并研究,则能增加分支图的信息位点,使分支图更近于似然.基于ITS、trnL-F、rps16序列MP分支图,新疆黑桑为最原始类型,乌克兰等栽培种为进化类型.     

地方鸡ONECUT1基因的序列变异分析

为探明ONECUT1基因在贵州地方鸡品种中的作用,分析ONECUTl基因在5个地方鸡品种的序列差异性,设计4对引物,筛选多态位点,采用DNAMAN进行序列变异分析。结果表明:4个多态位点均位于内含子上,分别是16 369位(C→A),16 517位(C→T),16 587位(C→G)和16 639位(C→T)。16 517位置仅长顺绿壳蛋鸡为碱基C,而瑶山鸡、赤水乌骨鸡、水西乌骨鸡和广西乌骨鸡在该位置为碱基T;瑶山鸡和赤水乌骨鸡在16 587位置和16 639位置检测出多态性,长顺绿壳蛋鸡、水西乌骨鸡和广西乌骨鸡则与数据库参照序列一致。     

基于Cyt b基因序列的大叶蝉亚科部分种类分子系统学分析

为探讨吸汁类害虫大叶蝉亚科种类间的系统发生关系,选用线粒体Cyt b基因432 bp片段进行扩增、测序,分析大叶蝉亚科9属21种昆虫的系统发育关系.结果表明:Cyt b基因的多序列中,有227个核甘酸变异位点,变异率为52.5％,简约信息位点206个,占总位点数的47.7％;T、C、A、G碱基平均含量分别为38.8％、17.4％、33.2％、10.6％,A+T平均含量为72.0％,明显高于G+C含量(28.0％).T、C转换大于A、G,T、A颠换占主体.密码子第1、3位点转换已达到一定饱和.以横脊叶蝉亚科(Evacanthinae)的2种类(黑条脊额叶蝉、褐带横脊叶蝉)以及杆叶蝉(Hylicinae)作为外群,基于432 bp编码的144个氨基酸序列构建了系统树,MP树和NJ树结构基本一致,均支持大叶蝉各属的单系性,构建的系统树和雄性外生殖器一些特征演化吻合.故Cyt b基因是大叶蝉亚科属种系统发育十分有效的基因.     

牦牛GH基因多态性的PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术对天祝白牦牛和青海高原牦牛的生长激素基因(GH基因)5个外显子及部分内含子序列进行遗传变异分析,以探讨牦牛GH基因的遗传特性.结果表明:2个牦牛群体GH基因第1、第2和第4外显子无多态性,第3内含子1694bp处均发生T→C转换,形成A、B2个等位基因,并检测到AA、AB和BB共3种基因型;天祝白牦牛第5外显子2373bp处发生G→T碱基颠换,形成C、D2个等位基因,检测到CC和CD2种基因型,但碱基改变并未引起氨基酸变化,因此这种碱基转换为沉默突变;天祝白牦牛和青海高原牦牛均为低度多态,经Hardy-Weinberg平衡检验2个牦牛群体均处于非平衡状态.     

鸭生长素基因单核苷酸多态性分析

根据GenBank上已经公布的鸭生长素(Ghrelin)基因的DNA全序列(GenBank登陆号:EF613552)设计8对引物,通过PCR-SSCP和DNA测序方法寻找高邮鸭、金定鸭、北京鸭、建昌鸭、连城白鸭、攸县麻鸭、绍兴鸭及莆田黑鸭等8个国家级保护鸭品种Ghrelin基因单核苷酸突变位点.结果发现3个突变位点,分别为157 bp处9 bp的缺失、431 bp处T→C的突变、909 bp处A→G的突变(该突变引起了苏氨酸→丙氨酸的变化).北京鸭的等位基因A频率显著高于其他鸭品种;绍兴鸭的等位基因C频率显著高于其他鸭品种;攸县麻鸭等位基因E频率高于其他鸭品种;连城白鸭的等位基因A、C和E的频率均低于其他品种,反映了连城白鸭独特的种质特性.     

利用5'LongSAGE标签分析蜜蜂肌球蛋白调节性轻链基因MLC-2选择性转录起始位点

使用西方蜜蜂雄蜂头部5’LongSAGE文库中的肌球蛋白调节性轻链基因MLC-2的标签序列,在蜜蜂全基因组序列上定位了该基因的转录起始位点(TSS),并进而预测了其启动子的结构。结果显示:蜜蜂MLC-2基因存在17个TSS,其中16个定位于MLC-2基因开放阅读框上游100bp的范围内。MLC-2基因的各TSS的使用效率不同,其中有3个优势TSS,由之起始的转录本分别占该基因总转录本数量的9.76%、54.47%和11.38%。从碱基组成来看,蜜蜂MLC-2基因TSS的第1个碱基为A、G、T、C的概率分别为58.8%、29.4%、0和11.8%。MLC-2基因的启动子结构预测结果表明,在TSS上游的300bp区域内有3个核心启动子元件。研究结果对研究蜜蜂MLC-2基因的表达调控与确定其全长cDNA序列具有重要意义。     

朝鲜鹌鹑MHC class Ⅰ基因第2、3外显子多态性与NDV抗性的关联分析

【目的】研究朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第1,2和3外显子的多态性,并与新城疫病毒抗性进行关联分析。【方法】采用胸肌注射的方法对14日龄朝鲜鹌鹑进行新城疫La Sota弱毒株攻毒,每周注射1次,连续攻毒3周后,心脏采血,采用β-微量法测定血清中新城疫抗体水平。PCR扩增朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因,测序后采用DNA Star、SPSS等分析软件研究朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第1,2,3外显子的多态性,并分析不同基因型新城疫抗体水平的差异。【结果】朝鲜鹌鹑的新城疫抗体效价为26～210。PCR扩增获得了1 290bp的MHC classⅠ基因,其编码区序列为780bp,编码259个氨基酸。通过与已知序列日本鹌鹑RNA(AB005528)比对,得到长度分别为76,272和274bp的第1,2和3外显子。在第1外显子上未检测到突变为点,在第2和3外显子上共检测到11个突变位点(第2外显子上4个突变位点:257bp(A/C)、267bp(A/T)、366bp(A/G)和500bp(T/G);第3外显子上7个突变位点:795bp(T/C)、798bp(T/C)、810bp(T/G)、830bp(A/G)、873bp(A/T)、927bp(A/G)和932bp(C/G)),均为中度多态基因座,11个突变位点中,267bp(A/T)、830bp(A/G)、873bp(A/T)、932bp(C/G)突变导致编码氨基酸改变,500bp(T/G)、873bp(A/T)、932bp(C/G)突变位点基因型之间新城疫抗体水平存在显著差异(P0.05)。【结论】朝鲜鹌鹑MHC classⅠ基因第2、3外显子具有丰富的多态性,并且与新城疫病毒抗性相关。     

滩羊H-FABP基因序列测定及分析

采集2、4、6、9、12、18月龄共计120只滩羊血液标本,PCR扩增H-FABP基因,进行酶切和测序.结果表明:H-FABP基因在滩羊群体中存在多态性,扩增的目的基因序列长度分别为285 bp、258 bp.通过测序发现外显子2在236、241、249处分别发生了A→C、C→T、T→G的单碱基突变.外显子3在103、164处分别发生了T→C、G→A的单碱基突变.