斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ基因组DNA同源重复区生物信息学分析

利用生物信息学方法,对斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ型分离株基因组DNA序列进行分析。结果表明,斜纹夜蛾核型多角体病毒Ⅱ基因组DNA含有7个同源重复区,分别包含3~8个64 bp不完全回文序列,在回文序列中心均含有一个Pvu I限制性酶切位点,并且存在多个正向或反向互补的重复序列和与病毒基因组DNA复制相关的motif基序,对7个hrs中40个回文序列进行比对分析,发现其序列的核苷酸一致性高达90%以上。     

核桃早实性相关SCAR标记(1-1500)基因末端序列的克隆

[目的]克隆SCAR标记的核桃早实性相关基因片段[1](AFLP早实分子标记转化成的SCAR标记)的末端序列,为验证其功能和早实核桃分子育种奠定基础.[方法]采用RACE技术对SCARE标记的核桃早实性相关基因片段设计特异性PCR引物,并扩增其末端序列.[结果]分别获得了长度为453 bp和463 bp的片段,通过与NCBI核酸数据库中已经发表的序列进行比对分析,发现该基因3'末端含有358个核苷酸非编码序列.其核酸序列与葡萄假定蛋白相应部位同源性为55.26;,与葡萄重叠群相应部位同源性为38.38;,与线虫枯粒Y38F2AR基因全序列相应部位相似性为40.86;,和野猪免疫球蛋白超家族成员相应部位的相似性为39.75;,具有poly(A)尾.5'末端含有248个核苷酸非编码序列,其核酸序列与葡萄重叠群基因组鸟枪全序列相应部位同源性为39.07;,与拟南芥基因组DNA 3号染色体相应部位的同源性为42.22;,与嗜热四膜虫假定蛋白基因序列相应部位相似性为44.53;,和斑马鱼DNA序列DKEY-120E17克隆2号连锁群全序列相应部位相似性为42.30;.[结论]试验采用的3'和5'末端快速扩增技术(3'RACE和5'RACE技术)能很好地扩增核桃早实性相关基因的末端序列.     

加州鲈弹状病毒三水株全基因组序列测定及分析

【目的】对加州鲈弹状病毒弱毒三水株(MSRV-SS-7)及其母源株(MSRV-SS)进行全基因组克隆和测序分析。【方法】采用分段扩增方法对MSRV-SS-7及MSRV-SS基因组核心序列进行PCR扩增,第1轮根据鳜鱼弹状病毒(SCRV)基因序列(NC_008514.1)设计10对引物进行扩增并测序;在第1轮扩增产物测序、拼接基础上,设计8对引物进行第2轮扩增,拼接后获得基因组核心序列。同时用cDNA末端快速扩增法(RACE)获得3′和5′末端序列。采用Vector NTI 8.0对基因组核心序列和末端序列进行拼接,获得基因组全序列,使用Clone Manager 8.0对MSRV-SS-7和MSRV-SS进行序列比对分析;同时使用DNAMAN将基因组G基因序列转换为氨基酸序列,并通过MEGA 5.0与其他鱼类弹状病毒的G蛋白氨基酸序列进行进化树分析。【结果】MSRV-SS-7及其母源株MSRV-SS基因组全长均为11 548 bp,包含N、P、M、G、L等5个结构基因,基因组结构为3′Leader-N-P-M-G-L-Trailer 5′;MSRV-SS-7与MSRV-SS全基因组中共有10处核苷酸不同。G蛋白进化分析表明,MSRV-SS-7及母源株MSRV-SS与SCRV亲缘关系最近,且与鲈鱼弹状病毒属(Perhabdovirus)聚为一支。【结论】克隆分析了MSRV-SS-7的全基因组序列,可以用于后续活疫苗的开发。     

景天科植物基因组DNA的高效提取方法

采用CTAB法,低浓度的乙醇与NaCl沉淀DNA,再用正丁醇进一步萃取多糖,建立了景天科特种植物的DNA提取方法,获得的DNA经琼脂糖电泳和紫外分析仪检测,浓度和质量均较高。用线粒体nad7基因的特异引物对该法提取的大花红景天DNA进行扩增,获得了长为791bp片段的目标序列。结果表明:该法有利于去除景天科植物材料中多糖、多酚类和RNA等物质,获得的高质量基因组DNA完全可以满足各种分子生物学研究的要求。     

绍兴鸭线粒体基因组全序列测定与分析

参照近源物种线粒体基因组序列设计15对引物,通过PCR扩增、测序、拼接,获得绍兴鸭(Anas platyrhychos)线粒体基因组全序列并进行序列分析。绍兴鸭线粒体基因组全长16 604 bp,碱基组成为29.20%A,22.19%T,15.78%G,32.83%C,包含13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因和1个非编码控制区(D-loop),基因组成及排列顺序与其他鸟类相似,表明鸟类线粒体DNA进化上有较高的保守性。     

斑茅过氧化氢酶基因(EaCAT-1a)克隆与序列分析

斑茅是栽培种甘蔗最重要的近缘物种之一,具有抗逆性强等特点。本文以高粱过氧化氢酶基因(NCBI登录号为XM002437586.1)c DNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证成功分离了1个斑茅过氧化氢酶基因DNA序列(Ea CAT-1a,Gen Bank登录号为KF864223)。该序列全长3831 bp,包含8个外显子和7个内含子,c DNA序列长为1532 bp,包含10 bp的5’非翻译区(UTR)和43 bp的3’UTR,以及一个1479 bp的开放读码框,编码492个氨基酸,此蛋白序列具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。将推测的Ea CAT-1a蛋白序列与高粱、水稻、玉米等物种进行同源进化分析,均表现出较高的保守性。     

鲫鱼基因组DNA的扩增及在SSR分析中的验证

【目的】优化鲫鱼全基因组DNA扩增方法。【方法】使用内切酶酶切初孵仔鱼的基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头,根据酶切位点序列与接头序列设计引物,采用PCR法扩增酶切片段,增加基因组DNA的数量。【结果】使用Taq I内切酶酶切鲫鱼基因组DNA,酶切片段连接寡核苷酸接头后PCR扩增,获得扩增产物集中于250～1 500 bp。以扩增的滇池高背鲫鱼基因组DNA为模板,PCR扩增滇池高背鲫鱼的微卫星分子标记(SSR)位点,获得预期的扩增片段,电泳图谱与对照组(未扩增的基因组DNA为PCR模板)无差异。【结论】本研究优化了鲫鱼基因组DNA的扩增方法,并可用于SSR分析中,为鱼类大规模遗传分析提供了技术支撑。     

甜菜幼苗低温和长日照诱导表达基因的克隆和序列分析

 以代表性差异分析cDNA-RDA(representational difference analysis of cDNA)方法获得在低温和长日照诱导甜菜(Beta vulgaris L)幼苗茎尖中差异表达的基因片段DP3，并进行了cDNA的末端快速扩增（rapid amplification of cDNA ends），经RT-PCR 扩增和基因组DNA中PCR扩增，克隆测序后获得1个全长609 bp的cDNA和855 bp的DNA序列，分别命名为Ty7Br600 和Ty7Br900，并在GenBank注册，登录号分别为AY324115和AY324114。在GenBank中比较未发现同源序列，可能为新基因。序列分析发现，Ty7Br600具有1个编码136个氨基酸的开放读码框（ORF）, Ty7Br900序列中存在1个内含子。分别以克隆的低温诱导甜菜幼苗cDNA为探针，分别进行Northern印记和Southern印记杂交。结果表明，cDNA差异片段只在低温诱导的甜菜中表达，在甜菜基因组中以2个拷贝或低拷贝形式存在。     

基因组步移技术克隆稀有鲫角蛋白18基因序列及序列分析

角蛋白18是角蛋白的一种,属于S型角蛋白,是在哺乳动物和两栖类动物胚胎发育中第一个表达的中间纤维蛋白。根据已发表的人、爪蟾及斑马鱼角蛋白18 DNA序列,通过DNAman同源性比较获得保守序列,并从中设计二对引物。从稀有鲫基因组中PCR扩增得到2 779 bp的角蛋白18的DNA序列片段;通过基因组步移,分别获得该基因的上游和下游序列片段;最后将获得的全基因片段克隆至质粒载体pMD19-T进行序列测定检验。结果显示所克隆的稀有鲫角蛋白18基因全长3 765 bp。对该基因进行NCBI的Blastn同源性比较分析,表明稀有鲫同斑马鱼比较角蛋白18 DNA序列存在73.6%同源相似性;同时对该基因进行生物学分析,开放阅读框(Open ReadingFrame,ORF)预测表明稀有鲫角蛋白18是含有7个外显子和6个内含子,共编码367个氨基酸的蛋白质。研究亮点:首次成功克隆了稀有鲫角蛋白18基因全长序列3 765 bp,并且通过软件预测分析得出氨基酸序列,把氨基酸序列在DNA序列中进行标记,显示稀有鲫角蛋白18基因全长序列含有7个外显子和6个内含子,共编码367个氨基酸。另外,没有采用常用的从RNA反转...     

暗纹东方中BAFF基因相关序列的性质探讨

[目的]为探索暗纹东方基因组中是否存在BAFF基因。[方法]通过比对人、小家鼠、野猪、原鸡的BAFF基因cDNA序列,获取高度保守的同源片断。根据红鳍东方基因组文库序列设计引物,从野生暗纹东方肌肉样品中提取总DNA进行PCR扩增,并进行PCR产物的克隆与测序。[结果]通过PCR扩增获得3条特异性条带,大小分别为542、349、221 bp。在红鳍东方基因组文库中未找到与542 bp序列匹配的片段。349和221 bp序列在暗纹东方和红鳍东方中是保守的。暗纹东方与红鳍东方序列比对结果表明,碱基突变的主要方式为插入或缺失。[结论]3个扩增条带为BAFF基因相关序列的可能性较小。在鱼类生物体中很可能不存在与哺乳类、鸟类BAFF同源基因。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（ESTcontig110和ESTcontig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列ESTcontig110和ESTcontig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对ESTcontig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。     

Construction of a general human chromosome jumping library, with application to cystic fibrosis

In many genetic disorders, the responsible gene and its protein product are unknown. The technique known as "reverse genetics," in which chromosomal map positions and genetically linked DNA markers are used to identify and clone such genes, is complicated by the fact that the molecular distances from the closest DNA markers to the gene itself are often too large to traverse by standard cloning techniques. To address this situation, a general human chromosome jumping library was constructed that allows the cloning of DNA sequences approximately 100 kilobases away from any starting point in genomic DNA. As an illustration of its usefulness, this library was searched for a jumping clone, starting at the met oncogene, which is a marker tightly linked to the cystic fibrosis gene that is located on human chromosome 7. Mapping of the new genomic fragment by pulsed field gel electrophoresis confirmed that it resides on chromosome 7 within 240 kilobases downstream of the met gene. The use of chromosome jumping should now be applicable to any genetic locus for which a closely linked DNA marker is available.     

Construction of a Fosmid genomic library of Streptomyces roseoflavus Men-myco-93-63

To clone the antibiotic biosynthesis gene cluster of Streptomyces roseoflavus Men-myco-93-63, we constructed a Fosmid genomic library. The genomic DNA of the strain Men-myco-93-63 was isolated by the modified CTAB procedure, and the size of most genomic DNA fragments was larger than 150 kb. Then, a Fosmid genomic library containing more than 6000 clones was constructed. The average size of the inserted DNA in recombinant plasmids was 38.1 kb, and the probability of harboring any gene in the genome of the strain Men-myco-93-63 was 99.99%. The library coverage was at least a 10-fold genome equivalent. Therefore, the constructed Fosmid library meets the requirements as a standard genomic library     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库部分EST序列的电子克隆及验证

【目的】探讨从EST序列电子克隆全长基因序列的有效性,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供新方法。【方法】以正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库测序所得的EST序列作为起始材料,应用生物信息库对文库中的部分EST序列进行电子克隆,并用RT-PCR验证其准确性。【结果】电子克隆正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库序列,共获得20条片段重叠群（Contigs）,经基因注释,证实其均得到了有效延伸,具有完整开放阅读框（ORF）,其中已知的猪基因序列14条,猪新基因序列6条;从已知猪基因序列和未知猪新基因序列中各抽取1条感兴趣序列（EST contig110和EST contig133）进行全长cDNA预测,发现电子克隆所得序列EST contig110和EST contig133的预期扩增片段（ORF）与实际扩增片段（ORF）基本一致,核苷酸相似性在98.0%以上,氨基酸相似性在93.0%以上。而对EST contig133的ORF序列（猪的60S核糖体蛋白L18a亚基）进行基本特性及结构预测,发现ORF133蛋白为非分泌型蛋白,由6个折叠和6个螺旋结构组成,含有8个不同的磷酸化位点。【结论】从EST序列电子克隆全长基因是可行的,为今后快速克隆和研究免疫相关基因提供了参考。     

棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组文库的构建

【目的】构建棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,为研究棉花线粒体基因组结构以及棉花细胞质雄性不育的形成机理提供基础。【方法】在借鉴其它作物的线粒体基因组BAC文库构建方法的基础上,对棉花线粒体DNA的提取及其BAC文库的构建进行探索和优化,构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系的线粒体BAC文库,并采用同源克隆的方法克隆棉花线粒体的功能基因。【结果】构建的不育系和保持系的线粒体基因组文库分别包括2 600个克隆,插入DNA片段大小在10.3 kb和37.5 kb之间,平均分别为22.29 kb和21.36 kb。重组子的覆盖率分别达到棉花线粒体基因组的79倍和76倍。获得了3个棉花线粒体功能基因序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系的这3个基因序列无差异;以这3个基因为探针筛选文库,均获得阳性克隆。【结论】分别构建了棉花晋A细胞质雄性不育系及其保持系线粒体基因组的BAC文库。获得了晋A不育系与其保持系的orfB,coxⅠ和nad4L 3个基因的全序列,通过比较,证明晋A不育系与其保持系在orfB、coxⅠ和nad4L基因全序列上无差异。     

毛竹大片段双元细菌人工染色体基因组文库的构建

从毛竹Phyllostachys pubescens幼嫩叶片中提取纯化得到高质量的基因组DNA,经限制性内切酶BamH I对它们进行梯度酶切,脉冲场电泳选择合适酶切DNA片段,与脱磷酸化处理过的质粒载体pCLD04541按质量比3∶1相互连接,转化大肠杆菌Escherichia coli DH10B感受态细胞进行蓝白斑筛选,挑取白色克隆,获得重组率较高的阳性克隆,构建了含有10⁴个克隆的双元细菌人工染色体（BIBAC）基因组文库,并通过脉冲场电泳检测分析后确定,所构建的毛竹BIBAC文库平均插入片段为105 kb,约覆盖5倍毛竹基因组。该文库的构建为毛竹基因组研究做好了前期的基础工作。图8参18     

南瓜基因组DNA的细菌人工染色体(BAC)文库的构建

[目的]构建南瓜基因组DNA的细菌人工染色体(BAC)文库。[方法]以南瓜幼芽为材料,利用HindⅢ酶切体系,初步构建南瓜基因组DNA的BAC文库。[结果]研究成功构建了南瓜基因组DNA的BAC文库。[结论]该技术为南瓜相关基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和基因组测序等研究工作奠定了基础。     

双孢蘑菇不同交配型同核不育单孢的基因组文库构建

对24个双孢蘑菇不育单孢进行两两杂交配对,以菌株9608为基准,获得了2种不同交配型的不育单孢菌株A+:9601、9608、9609、9612、AgQG841-1、AgLH830-4、AgLH830-6、AgQL8125-5;A-:9602、9603、9604、9607、Ag2k811-1、M7206-1、M7206-2、M7206-11、M7206-13。将这2种菌株进行DNA提取,并构建DNA文库,对文库进行酶切验证,用SalⅠ酶切,可切出20、14、9kb等3个片段,其中20、9kb为λ载体的左右臂,插入片段为14kb,与预期相符,说明文库的质量较高。     

Genomic sequencing of Pleistocene cave bears

Despite the greater information content of genomic DNA, ancient DNA studies have largely been limited to the amplification of mitochondrial sequences. Here we describe metagenomic libraries constructed with unamplified DNA extracted from skeletal remains of two 40,000-year-old extinct cave bears. Analysis of approximately 1 megabase of sequence from each library showed that despite significant microbial contamination, 5.8 and 1.1% of clones contained cave bear inserts, yielding 26,861 base pairs of cave bear genome sequence. Comparison of cave bear and modern bear sequences revealed the evolutionary relationship of these lineages. The metagenomic approach used here establishes the feasibility of ancient DNA genome sequencing programs.