禽腺病毒4型SD2015株对SPF鸡的致病性研究

2015年从临床发病肉鸡鸡群中分离到1株禽腺病毒,经PCR鉴定及同源性比对确定为血清Ⅰ群4型禽腺病毒,对其肝组织毒及适应SPF鸡胚与鸡胚肝细胞的细胞毒进行致病性研究。结果显示:肝组织毒毒力最强且传代稳定;肝组织毒经肌肉注射途径攻毒,试验鸡发病率及死亡率略高于皮下注射而远高于口服感染途径;随攻毒鸡日龄的增长,其对腺病毒的感染力下降;肝组织毒攻毒量为108.0TCID50/只,可引起攻毒鸡8/10以上死亡,10/10感染,感染鸡剖检有典型的心包积水、肝脏肿大、肾脏肿大等病变。本试验结果对Ⅰ群4型禽腺病毒灭活疫苗免疫效力评价具有重要意义。     

新流法三联疫苗对马立克氏病活疫苗的干扰研究

为了研究1日龄雏鸡同时免疫新流法三联疫苗与马立克氏病活疫苗对马立克氏病活疫苗免疫效果是否有干扰,试验将1日龄雏鸡分为5组,第1组商品蛋鸡不免疫,第2组SPF鸡不免疫,第3组商品蛋鸡仅免疫马立克氏病活疫苗,第4组商品蛋鸡同时接种新流法三联疫苗与马立克氏病活疫苗,第5组空白对照鸡不免疫,于雏鸡8日龄时对第1～4组用马立克氏病超强毒Md5株进行攻毒,攻毒后90 d内连续观察临床症状、剖检变化及病理组织学变化。结果表明:第1,2组鸡出现精神沉郁、肢体麻痹等临床症状并有部分鸡死亡,对死亡鸡只剖检可见,肝脏、脾脏肿大,全身器官出现肿瘤;对剖检鸡只进行组织病理学观察,可见典型的马立克肿瘤病变。而第3～5组鸡则无任何临床病症出现。说明无论是单独免疫马立克氏病活疫苗或是与新流法三联疫苗同时免疫,均能对鸡只提供良好保护,同时免疫新流法三联疫苗与马立克氏病活疫苗不会影响马立克氏病活疫苗的免疫效果。     

Ⅰ群4型禽腺病毒卵黄抗体被动免疫持续期的研究

本实验取3批实验室试制的卵黄抗体,按1.0m L/只肌肉接种21和42日龄SPF鸡,分别在注射抗体后1、3、5和7d攻毒,观察攻毒保护情况。结果显示,试验鸡接种抗体后1~5d注射I群4型禽腺病毒强毒,攻毒保护率均在90%以上;注射后7d的攻毒保护率为46.7%~50%;各时间点攻毒对照组鸡均90%~100%发病,剖检试验鸡,死亡和发病鸡均呈典型的心包积液及肝脏肿大和坏死的病理变化;健康对照组均100%健活。说明注射抗体后5d抗体仍能产生良好地保护作用,而7d后保护作用大幅减弱。因此,确定I群4型禽腺病毒卵黄抗体被动免疫保护期为5d。     

禽腺病毒4型感染病理组织学观察

将30只1日龄SPF鸡随机分为2组,其中攻毒组20只,对照组10只。攻毒组按每只0.2mL腹腔注射禽腺病毒4型(FAV-4)病毒液,对照组不做处理,隔离饲养,临床观察2周。攻毒后第3天攻毒组开始出现死亡,将死亡鸡解剖观察各器官大体病变,经聚合酶链式反应(PCR)检测为FAV-4后,采集心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏制作石蜡切片,观察病理组织学变化。结果显示,攻毒组死亡鸡只无明显临床症状而突然倒地死亡;主要剖检病变为心包积液、肝脏肿大,个别可出现脾脏肿大、肺脏淤血、肾脏肿大;病理组织学变化为肝脏、肺脏、肾脏淤血,细胞变性坏死;而对照组无任何异常症状和病理组织学变化。     

1株禽4型腺病毒JS株的分离鉴定

自2015年以来,心包积液-肝炎综合征在我国部分地区暴发并造成大量肉鸡死亡,从而给养殖户带来巨大的经济损失。2017年从江苏省某发病鸡场的患鸡肝组织中分离获得了1株禽腺病毒4型(fowl adenovirus 4, FAdV-4),将其命名为JS株。Hexon基因同源进化分析显示,该病毒株为我国近期流行株。为了验证该病毒株对鸡的致病性,将10~(6.0)TCID_(50)的病毒用肌肉注射或口服的方式感染3周龄SPF鸡,连续观察14 d。结果发现:肌注组鸡在攻毒后24 h有精神沉郁的症状,在攻毒后第2～3天大批量死亡,死亡率达90%;而口服组鸡一直没有观察到明显的精神症状且死亡率为0。病死鸡剖检可见心包积液、肝脏肿大发黄、肾脏肿大出血、脾肿大等明显病变;荧光定量PCR检测结果显示,病毒在鸡体内多个组织器官均有分布。结果表明本研究分离获得了1株对鸡有较强致病性的FAdV-4毒株,为有效防控心包积液-肝炎综合征奠定基础。     

血清4型禽腺病毒强毒株GY株的分离鉴定和致病性研究

从山东某疑似感染禽腺病毒的发病鸡群中采集病料并分离到一株禽腺病毒,克隆纯化后进行PCR检测和序列分析,鉴定该毒株为血清4型禽腺病毒,命名为GY株。用LMH细胞繁殖的GY株病毒滴度可以达到107.5 TCID₅₀/0.1mL,并建立了纯净稳定的种子批。动物致病性试验结果显示,攻毒鸡只8/10死亡,剖检均出现心包积液,肝脏肿大、出血或坏死,表明该毒株为强毒株。就攻毒途径、攻毒剂量等方面研究发现,GY株经胸部肌肉注射后发病率和发病时间相对颈部皮下注射途径更有优势,确定攻毒途径为肌肉注射;通过比较不同剂量(5×10^3.0~5×10^6.0 TCID50)GY株病毒攻击SPF鸡的致病性,将攻毒剂量定为5×10^5.0 TCID₅₀。研究表明,GY株可作为禽腺病毒4型攻毒用强毒株。     

蛋鸡禽腺病毒4型流行毒株SX17株的分离与鉴定

从陕西渭南蛋鸡场疑似心包积液-肝炎综合征病例中分离鉴定病原,并研究其致病性与分子特征,为防控心包积液-肝炎综合征提供参考。采集并处理临床样品,通过SPF鸡胚绒毛尿囊膜接种传代分离病毒,测定分离毒株的血凝性和鸡胚半数致死量(ELD50),进行攻毒试验、组织病理观察和病毒在不同组织中的分布检测,测定hexon基因序列并比对分析。结果显示,病毒传至第5代后鸡胚死亡出现规律性,鸡胚不同部位病毒分布检测发现肝脏、卵黄囊、尿囊液和绒毛尿囊膜中有病毒分布,将获得的病毒命名为SX17株。血凝性测定结果表明,SX17株对鸡、鸭、鹅红细胞均无血凝特性;测得ELD50为10-3.54/0.1mL;攻毒2d后试验鸡陆续出现临床症状,病理组织学检查肝脏、脾脏、心脏和肾脏均有典型变化;攻毒死亡鸡只肝脏、肠道、心包积液和肾脏中有病毒分布,在肌肉、粪便、心肌、肺脏和气管中未检测到病毒核酸。hexon基因序列比对提示SX17株为FAdV-4型流行毒株。结果表明,鸡胚分离血清4型禽腺病毒可收获肝脏、卵黄囊、绒毛尿囊膜和尿囊液,临床病例样品采集以肝脏、肠道、心包积液和肾脏为佳,分离到的SX17株为致病性较强的FAdV-4型流行毒株。     

鸡滑液囊支原体活疫苗(MS-H株)同时免疫对新支二联活疫苗免疫效力影响的调查

为了解新支二联活疫苗和鸡滑液囊支原体活疫苗之间有无相互影响,选用70只1日龄SPF鸡随机分为4组进行比对试验,其中:G1组20只,联合免疫新支二联苗活疫苗和鸡滑液囊支原体活疫苗(MS-H株);G2组20只,为新支二联活疫苗单独免疫组;G3组20只,为传染性支气管炎病毒(IBV)攻毒组;G4组10只,为空白对照组。免疫后21 d时采血,血凝抑制(HI)试验进行新城疫(ND)血清抗体检测,同时G1、G2和G3组IBV强毒点眼攻毒,并于攻毒后第5天剖检,进行气囊评分。所有试验鸡剖检时,采集气管进行IBV再分离及病理观察。结果:G1和G2组的NDV抗体阳性率分别为94.74%和100%,其平均效价分别为4.26和4.35,剩余2组阳性率均为0;气管IBV再分离结果显示G1和G2组新支二联苗的保护率分别为88.24%和89.47%;气管病理学观察显示G3组出现了典型的传染性支气管炎(IB)病理变化,而G1组和G2组未出现明显IB病理变化。研究表明,同时免疫MS-H活疫苗并未对新支二联活疫苗的免疫效力产生影响。     

不同宿主源NDV毒株对SPF鸡致病性研究

为阐明不同宿主及不同基因型新城瘦病毒(NOV)对SPF鸡致病性,选择分离自鸡、番鸭、鹅、健康野鸟的基因VIId亚型NDV 6株,鸡源基因Ⅲ型和鸽源基因VIb型毒株各1株,以及基因Ⅸ型强毒F48E9,共9株NDV毒株进行致病性试验.在对各毒株的EID50及主要致病指数MDT、ICPI测定基础之上,以相同剂量感染15日龄SPF鸡,观察临床症状及剖检病变,计算发病率和死亡率,并在攻毒后不同时间采集主要组织样品.以SYBR Green I Real-time PCR检测病毒最早出现时间及病毒载量.结果表明,6株基因VIId亚型NDV毒株导致SPF鸡100%发病,死亡率90%以上,属于高致病性毒株;基因Ⅲ、VIb型毒株导致SPF鸡发病但不死亡,属于中等毒力毒株.VIId亚型毒株与F48E9株攻毒后SPF鸡在病理变化、组织嗜性及病毒载量上没有显著差异.根据毒株的MDT、ICPI指数及攻毒鸡病程综合判断,VIId亚型毒株在致病性上与F48E9株差异不显著.健康野鸟携带基因VIId亚型高致病性NDV,在NDV的自然生态传播过程中起重要作用,提示应该加强对野鸟的流行病学监测及相关研究.     

基因Ⅶ型新城疫强毒对樱桃谷鸭的致病性试验

用108ELD50基因Ⅶ型新城疫病毒(NDV)强毒对20只樱桃谷鸭和SPF鸡进行攻毒,同时分别设10只同日龄樱桃谷肉鸭和SPF鸡为空白对照,进行同居感染。试验鸭攻毒后1、4、7和14d取喉头、泄殖腔棉拭和肝、脾、肾等内脏组织进行病毒分离,同时采血进行ND抗体检测。SPF鸡攻毒后5d内100%死亡,对照组9d内100%死亡。试验鸭攻毒组和对照组在14d观察期内无明显临床症状,攻毒后第7天开始部分试验鸭喉头、泄殖腔棉拭和内脏分离到NDV,第14天试验鸭血清NDHI抗体阳性。结果表明NDV强毒感染鸭群后并不引起明显的发病、死亡,但是病毒可以在其体内复制,并通过喉头和泄殖腔排毒,具有重要的流行病学意义。     

超强马立克病病毒株的致病性研究

拟对一株超强马立克病病毒(MDV)SD2012-1株的致病性进行研究。将60只SPF鸡平均分成未免组、HVT免疫组和CVI988疫苗免疫组3组。于1日龄时对其进行马立克病(MD)疫苗免疫,于10日龄时进行SD2012-1攻毒;每天观察攻毒鸡临床症状,对病死鸡进行病理剖检和组织学观察;用PCR反应对感染鸡进行MDV跟踪监测。病理学研究结果显示:攻毒后第2周,试验鸡有轻微组织病变;攻毒后第6周,试验鸡有眼观病变,镜检有散在的肿瘤细胞团块;攻毒后第9周,试验鸡有明显的眼观肿瘤病变,镜检有大量肿瘤细胞聚集;SD2012-1可以突破CVI988疫苗免疫,引起高达30%的鸡发病。PCR跟踪监测结果显示:攻毒后第5天,未免组和HVT免疫组可检出MDV;攻毒后第10天,未免组和HVT免疫组阳性检出率均为100%,CVI988免疫组阳性检出率为30%;攻毒后第20天,3组试验鸡阳性检出率均为100%;用PCR检测病死鸡的肝、肾、肌胃、肠系膜、十二指肠、心和法氏囊样品的结果均为MDV阳性;攻毒300d后,健康存活鸡的羽髓PCR检测结果均为MDV阳性。结果表明,HVT疫苗对于SD2012-1株几乎无保护作用,超强马立克病病毒SD2012-1株能够长期在免疫鸡体内存在,突破免疫保护,引起发病,这对国内防控鸡马立克病提出了严峻挑战。     

广东一株猪伪狂犬病毒野毒的分离鉴定和致病性初步研究

为了证实广东阳江某猪场存在猪伪狂犬病毒(PRV)强毒力野毒感染,试验采用病毒分离鉴定及仔猪攻毒试验的方法,对该猪场保育猪群病料中存在的病毒进行分离鉴定,以及用15日龄含有母源抗体(中和效价水平为1∶16)的仔猪进行毒株致病性的初步研究。结果表明:从病料中成功分离出1株PRV野毒株GD-1406株;经滴鼻攻毒,试验Ⅰ组(病毒攻毒效价为1×106TCID50/m L)仔猪攻毒后第5天全部死亡,试验Ⅱ组(病毒攻毒效价为1×104TCID50/m L)仔猪攻毒后第4天死亡率达80%,第6天全部死亡;病理剖检显示,分离的PRV对试验组仔猪的多种组织器官造成肉眼可见的损伤,对照组正常。说明该猪场保育猪群中有PRV野毒强毒株存在。     

禽腺病毒感染SPF鸡的病变和病毒分布初步研究

鸡心包积液-肝炎综合征是一种急性传染病,由血清4型禽腺病毒引起。为了解该病原的主要致病特点,采用Ⅰ群4型禽腺病毒聊城分离株(SDLC 201601)接种SPF鸡胚,观察鸡胚病变;人工感染1日龄SPF鸡,对病死鸡进行剖检,观察主要病理变化,并采用PCR方法对各脏器进行病毒DNA的检测。结果发现,鸡胚试验组至接毒后第8天鸡胚全部死亡,接毒6 d后死亡胚出现心包积液、肝脏肿大、变性或出血及肾脏肿大、出血等典型病变。SPF鸡试验组在感染后第3天出现死亡并达到死亡高峰,第4天全部死亡,死亡率为100%,SPF鸡对照组无发病死亡;SPF鸡试验组死亡鸡主要病变在肝脏、心脏及肾脏等器官,其中肝脏的病变评分最高;死亡鸡的脑、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、气管、胰腺、小肠、法氏囊、肌胃、腺胃等脏器均检测到该病毒的DNA。表明该毒株对1日龄SPF鸡感染性强,可侵袭各组织脏器,为全身性感染,致死率可达100%。     

珍珠鸡用马立克强毒攻击后的病理学观察

１日龄伊莎珍珠鸡和对照组红波罗雏鸡经腹腔用鸡马克强毒攻击，另设不攻毒珍珠鸡作对照，分别卫离饲养至１０周龄。对试验期死亡的鸡及试验结果时扑杀的鸡及珍珠鸡剖检，用肉眼观察大体病变及病理检查。结果表明，红波罗鸡于试验期内死亡率为４０％，并均可肝、肠、睾丸、卵巢等处到肿瘤，珍珠鸡则无一死亡，也不表现肿瘤。病理切片观察到攻毒珍珠鸡部分器官只出现少量的淋巴细胞炎性浸润。初步认为这是珍珠鸡对马立克病毒的一种防御     

血清4型鸡腺病毒AHHN分离株全基因组测序及其致病性研究

为明确一株I群C亚群鸡腺病毒血清4型(FAdV-4)AHHN分离株基因组特征及其致病性,本研究对该病毒的全基因组序列进行测定,结果显示:AHHN分离株的基因组全长为43723bp,G+C含量为54.87%,ORF29序列具有FAdV-4变异株29aa缺失的特征。0.1mL/羽(1×10^5TCID50)病毒量肌肉注射3周龄SPF鸡2d后,感染鸡出现急性感染症状,5d内全部死亡;剖检可见其肝脏变黄,表面大量出血灶,伴有心包积液、胸腺萎缩、法氏囊萎缩等眼观病变;病理组织学观察显示,感染鸡肝脏呈现典型的嗜碱性包涵体肝炎病变;病毒载量测定结果显示,各脏器均有不同程度的病毒复制。上述结果表明,FAdV-4AHHN分离株对鸡具有高致病性及广泛的组织嗜性。本研究为进一步研究FAdV-4功能基因对病毒毒力的影响奠定了基础。     

鸭坦布苏病毒感染发病模型的建立

将168只35日龄无坦布苏病毒感染的樱桃谷肉鸭随机分成7组,每组24只,其中1~6组分别以不同含量的鹅源坦布苏JS804株病毒肌肉注射进行攻毒,对照组肌肉注射相同剂量的PBS。攻毒后每天观察临床症状。分别于攻毒后2、4、6、8、13、20 d每组随机取4只攻毒鸭扑杀,分别取每只鸭各脏器样品2份,用于套式RT-PCR检测和组织学分析。临床症状观察:试验鸭于攻毒后腿瘫、头颈扭曲、行走不稳。剖检各主要脏器均出现病变,其中以脾脏、肝脏、脑最为明显。套式RT-PCR:攻毒后8 d各脏器病毒阳性检出率最高,其中以脾脏检出率最高;由攻毒检测结果确定鸭的攻毒量为1.6×106TCID_(50)。组织病理学观察:脑、脾脏和肝脏病变明显。免疫组化定位:脾脏生发中心、脑血管内皮细胞和肝细胞均有棕黄色阳性信号。     

CAV对BWEL-SPE鸡的致病性试验及毒价测定

本实验用鸡传染性贫血病病毒标准株（CAV和Cux-1)和国内分离株（CAV M9905 CAV和H9906分别对BWEL-SPF雏鸡1-7家系进行1日龄和1月龄攻毒的致病性试验。1日龄雏鸡接种CAV Cux-1毒株，12天后观察到感染鸡的喙、腿、冠和爪等部位颜色变浅，16天剖杀，观察剖检变化，并进行IFA和PCR检测，确定感染率和CAV毒价。结果CAV Cux-1株对1日龄BWEL-SPF雏鸡半数感染量（CID50）为10^4.3/0.2ml。同时检测到CAV Cux-1株对1月龄BWEL-SPF雏鸡发病率为60%；CAVM9905和CAV H9906对1日龄BWEL-SPF雏鸡发病率为100%，死亡率为40%、20%。     

新型鸭肝炎病毒流行病学调查及免疫防治试验

本试验通过鸭胚尿囊腔接种，对我国部分省市采集的死于疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织进行病原分离，获得9个病毒分离株。这些分离株对10日龄鸭胚的致死率为100％，人工感染6日龄雏鸭的致死率为0～100％不等。死亡鸭呈角弓反张姿势，剖检可见肝脏肿大，有出血点或出血斑。将9株分离株经鸭胚传至第5代，收集鸭胚尿囊液毒测定这些毒株的ELD50为10^-7.32／0．2ml～10^-3.5／0．2ml不等。用鸡抗1型DHV及新型DHV的血清进行中和试验，结果表明：有7株为新型DHV，有2株为1型DHV。对实验室早期分离的新型鸭肝炎病毒B株经过鸭胚传代致弱后，收集鸭胚尿囊液毒稀释成不同倍数对1日龄雏鸭进行免疫，并于10日龄时用新型鸭肝炎强毒进行攻毒保护试验，结果B20株在20倍稀释时，保护率达100％。采集免疫的雏鸭血清，中和试验测定血清的效价，雏鸭在免疫后可检测到中和抗体，第10天时抗体水平达到高峰，然后呈逐渐下降趋势。结果表明，B株经过鸭胚传代致弱后在毒力下降的同时仍保留一定的免疫原性．可以作为疫苗的候选株。     

2株胶东地区Ⅰ群禽腺病毒分离株的致病性试验

将从胶东地区疑似Ⅰ群禽腺病毒(FAdV)感染的发病鸡的肝组织病料中分离鉴定出的FAdV-8b(FXWH-8b)株和FAdV-4(FXWH-4)株,通过腿部肌肉注射方式,以TCID_(50)10~(8.0) 0.2 mL/羽的剂量,接种15日龄的SPF鸡,临床观察其发病情况及临床表现,研究其毒力和致病性。临床观察和剖检结果显示:FXWH-8b株和FXWH-4株均能在24 h引起试验鸡只发病,表现明显的临床症状和典型的剖检病理变化。H.E.染色结果显示:2株分离株均在脑、胸腺、气管、心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、腺胃、胰腺、十二指肠、空肠、盲肠和法氏囊有较明显的病理变化,但均未发现核内包涵体。PCR检测结果显示:FXWH-8b株攻毒后72 h,FXWH-4株攻毒后48 h,在肝脏、肺脏、肾脏、腺胃、空肠和盲肠呈现100%的阳性率。免疫组化结果显示:FXWH-8b株和FXWH-4株均在肝脏存在强阳性信号;FXWH-4株在肾脏、十二指肠和空肠存在阳性信号。表明FXWH-8b株和FXWH-4株均对15日龄SPF鸡有较强的致病性,可侵害多个组织和器官。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗和变异株灭活疫苗的免疫效果评价

分别采用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1R致弱毒疫苗株和变异毒株灭活疫苗免疫接种40日龄～45日龄仔猪,免疫接种后4周,用高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN-4变异株强毒攻毒,攻毒后21 d剖检,取主要器官作病理组织学观察和病毒抗原定位.结果显示变异毒株灭活疫苗免疫攻毒后导致的病理变化和病毒抗原分布程度均明显高于CH-1R弱毒疫苗免疫组.免疫病理学研究结果表明CH-1R 弱毒疫苗对HU-4株强毒免疫保护效果好于变异毒株灭活疫苗.