水貂、狐狸和貉源犬瘟热病毒F蛋白信号肽区基因克隆及遗传变异分析

为了解近年来犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)在中国毛皮动物主要养殖区的流行情况及遗传变异情况,本试验于2012-2014年从山东、河北、辽宁收集疑似犬瘟热的水貂、狐狸和貉病料,经犬瘟热抗原检测试纸条检测和RT-PCR检测为阳性后,克隆测序了15株CDV F蛋白信号区(Fsp)基因序列.序列分析结果显示,15株CDV野毒株Fsp基因核苷酸序列和氨基酸序列的相似性均为93.6%~100.0%,与疫苗株相似性为80.7%~81.7%.基因系统进化分析结果显示,15株野毒株均属于中国当前流行的Asia-1基因型.氨基酸序列比对分析结果显示,Fsp蛋白在氨基酸3-14、16-37、47-67位等处存在高变异.通过对当前流行CDV野毒株Fsp基因序列分析,结果表明该Fsp基因区具有较高的变异率,可作为CDV基因分型的依据,同时本试验结果为毛皮动物犬瘟热的防控提供了参考依据.     

辽宁部分地区宠物犬犬瘟热病毒分子流行病学调查与分析

为了解犬瘟热病毒(CDV)遗传变异情况,先后从辽宁省沈阳、锦州、辽阳等地区的9个宠物医院收治的临床疑似犬瘟热(CD)病犬中采集了165份拭子样品及组织病料。利用CD抗原检测试纸条、RT-PCR检测方式筛选到8份阳性样品。H基因序列分析结果显示该8株CDV野毒株之间的H基因同源性为97.6%~99.9%,与疫苗(Onderstepoort)同源性为89.1%~90.9%;基因遗传进化显示,该8株毒株属于国内当前流行的Asia-1型,来源于沈阳的SY-35株与在北京发现的CDV强毒株BJ-09在同一进化分枝,其余来源于沈阳、锦州和辽阳的7株与东北地区流行的CDV在同一进化分枝;氨基酸序列比对结果显示,H蛋白在氨基酸235~245,415~425,595~605等处存在高变异,H蛋白3 555位置氨基酸的非同义置换概率相对比较高;糖基化位点以及抗原表位预测分析显示该8株CDV的H基因糖基化位点和抗原表位方面均与Asia-1型CDV野毒株相似,但与疫苗株相比变异较大,特别是我们发现JZ-6株丢失了1个潜在N-糖基化位点。结果表明:辽宁地区宠物犬CD流行以Asia-1型CDV为主,不同病毒株间存在遗传多样性。     

犬瘟热病毒YD株的分离鉴定及其H基因序列分析

从疑似犬瘟热(CD)病犬的脏器中分离到1株病毒,经间接免疫荧光试验、RT-PCR鉴定、红细胞凝集试验和对不同动物致病性试验,证实该病毒为犬瘟热病毒(CDV)强毒株,命名为CDV YD株。对H基因序列的测定和分析表明,YD株H基因与国内强毒株更接近,核苷酸同源性为98.4%~99.7%,氨基酸同源性为97.8%~99.7%,而与疫苗株核苷酸同源性较远为91.2%~91.5%,氨基酸同源性为90.3%~91.2%。推导的H蛋白氨基酸序列中有9个潜在的N连接糖基化位点(N-X-S/T),可能与病毒体外复制和中和抗体有关,另外有12个保守的半胱氨酸(Cys)残基,对H蛋白二级结构起重要作用;根据H基因核苷酸序列绘制的进化树表明,CDV YD株属于国内流行基因型:Asia-1型。该研究为了解当前中国CDV流行变异情况和犬瘟热疫苗的研发提供了数据。     

水貂犬瘟热CDV_3疫苗株基因组序列测定及H基因遗传稳定性分析

对水貂犬瘟热CDV3疫苗株基因组进行全序列测定与分析,以阐明该疫苗株的来源亲本毒株,基因特征及H基因遗传稳定性。将CDV3疫苗株基因组cDNA分9个重叠片段进行RT-PCR并克隆入pMD 18-T载体中,测定全长cDNA序列。并与CDV野毒参考株和疫苗株N、F和H基因氨基酸序列比对分析其基因变异情况。通过对CDV3疫苗株6个不同生产批次(Vero细胞培养代次)H基因序列测定以分析毒株的分子遗传稳定性。基因序列分析结果表明:CDV3疫苗株基因组全长15 690 bp,与CDV野毒株基因组同源性较低(93.0%~95.3%)。H基因核苷酸和氨基酸序列与Lederle疫苗株(EF418783)同源性最高,分别为99.6%和98.7%。而6个不同培养代次CDV3疫苗株H基因氨基酸序列无任何差异。由此证实CDV3疫苗株的亲本毒株与Lederle疫苗株有着最密切关系,不同培养代次的CDV3疫苗株H基因具有较高的遗传稳定性。     

犬瘟热病毒TN野毒株核蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中收录的犬瘟热病毒(CDV)Onolerstepoort株核蛋白基因(N)序列，设计了1对特异性引物，用该引物对分离的TN野毒株进行了RT-PCR扩增；将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T质粒连接，得到重组质粒pTN。经核苷酸序列测定，CDVTN株N基因的ORF全长1569bp，编码523个氨基酸；将TN野毒株与GenBank中收录的其他CDV毒株进行比较，N基因核苷酸序列的同源性为94％～99％，推导的N蛋白氨基酸序列的同源性为97％～99％。TN株与Onderstepoort疫苗株氨基酸序列的差异主要集中在N端(17～159位)和C端(408～519位)。中间的区域则高度保守。此外，在CDVN蛋白N端281～289位上也发现存在与麻疹病毒(MV)N蛋白完全相同的Y-P-A-L-G-L-H-E-F9肽序列，推测可能是诱导CTL活性的靶蛋白的抗原表位之一。氨基酸组成分析发现，推导的N蛋白氨基酸序列中亮氨酸、丝氨酸和异亮氨酸所占比例很高，提示该蛋白具有高度螺旋和缠绕的分子结构。     

非典型犬瘟热病毒核衣壳蛋白基因序列分析及其在大肠杆菌中的表达

为分析当地非典型犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的序列特征及其表达产物的抗原性,根据已发表CDV的N基因序列设计引物,用RT-PCR方法从引起非典型症状的CDV细胞培养物中扩增N基因,进行克隆和序列分析,结果表明:该非典型CDV的N基因与已发表的12个CDV强毒株的核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别在96.6%～99.2%和97.9%～99.4%之间,与已发表的4个CDV疫苗弱毒株的同源性分别在93.2%～93.6%和96.4%～97.5%之间;在N基因系统发育进化树上,非典型CDV与12个强毒株处在同一亚群,而且与9个中国分离毒株的亲缘关系近于3个国外毒株。N基因在大肠杆菌中表达的重组N蛋白的分子量为62 ku,主要以包涵体的形式存在;用western blot分析,重组N蛋白可与CDV阳性血清发生特异性反应;以纯化的重组N蛋白为抗原建立的CDV抗体间接ELISA检测方法具有良好的特异性。     

基于H蛋白基因的犬瘟热病毒遗传变异分析

犬瘟热是犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染犬和其他食肉动物造成的多发性、致死性传染病,本文从分子水平上探讨CDV遗传进化特性、变异情况与流行规律之间的关系.通过收集2002-2010年在中国地区分离的14株CDV野毒株、2006-2007年在全球各地分离的12株CDV野毒株以及从不同宿主分离的12株CDV野毒株和4株疫苗株,将其分为4组,将前3组野毒株分别与国内外正在使用的4株疫苗株的H基因进行遗传变异分析.分析发现,CDV野毒株与疫苗株间H蛋白基因的核苷酸相似性为86.2％～92.1％,其氨基酸相似性为89.1％～91.9％;H基因的584位的天冬酰胺糖基化位点是Asia-Ⅰ型CDV所特有的;H蛋白3555区域的非同义氨基酸替换概率较高.作者推测H蛋白抗原变异可能造成弱毒疫苗免疫效力降低,不能为某些CDV株的感染提供完全有效的保护.     

犬瘟热病毒SH202003株全基因组序列分析

为了解上海地区犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）遗传变异情况，本研究采用首尾重叠的11对特异性引物，对CDV上海株SH202003进行RT-PCR扩增，将扩增片段进行反复测序，序列拼接后最终获得了SH202003株全基因组序列，应用Lasergene 7.0和Mega 6.0软件对全基因及H基因进行序列分析，并构建系统进化树。结果显示，SH202003株基因组全长为15 690 bp，编码6种结构蛋白（N、P、M、F、H和L），H和L基因间隔序列为CUA，L和5'端尾随序列为CAA，与Hebei株核苷酸和氨基酸相似性最高，达到98.6%和96.6%，与疫苗株核苷酸相似性在92.2%~94.3%，氨基酸相似性只有82.7%~87.0%；全基因进化树中，SH202003株与流行野毒株在同一分支，与疫苗株在不同的分支；H基因同样与Hebei株亲缘关系最近，核苷酸和氨基酸相似性分别为98.7%和99.5%，与疫苗株Snyder Hill、CDV3、Convac及Onderstepoort亲缘关系较远；SH202003株处于Asia-1型分支，属于Asia-1型强毒株；SH202003株具有9个潜在N-糖基化位点，与强毒株Hebei株一致。研究表明，上海株SH202003属于CDV强毒株，为Asia-1型，其H基因序列相对保守，具有9个潜在N-糖基化位点，但是全基因序列存在较多突变，与疫苗株的匹配度较差，可能是免疫犬依然发生犬瘟热的主要原因。     

貉源犬瘟热病毒血凝素基因的克隆及序列分析

为了对1例貉源犬瘟热(CD)进行病毒检测并分析其血凝素H基因变异情况,本研究从1只疑似犬瘟热病死的貉采病料进行研磨,利用RT-PCR方法扩增犬瘟热病毒H基因,对扩增出的H基因片段进行克隆测序,并对得到的H基因序列进行分析。结果表明,该貉感染犬瘟热病毒,得到的H基因核苷酸和氨基酸序列与CDV野毒株同源性较高,分别为89.1%~98.0%和85.4%~97.5%。遗传进化分析表明其属于Asia-1型野毒株,N连接糖基化位点分析结果表明,该毒株在542aa处比参考野毒株多了1个潜在的N糖基化位点,在525aa-550aa间多出了1个抗原表位。     

犬瘟热病毒分离株N、H、F蛋白基因的变异分析

通过RT-PCR方法扩增到犬瘟热病毒(canine distemper virus,CDV)分离株GS0812-4的N、H、F蛋白基因,然后克隆入pGEM-T Easy载体并进行序列分析和抗原表位预测分析。结果表明,GS0812-4分离株的N、H、F蛋白基因与其他分离株相应序列的核苷酸同源性分别为93.2%~97.8%、90.3%~97.3%、93.2%~97.8%,其推定的氨基酸同源性分别为96.6%~98.7%、91.3%~97.9%和96.6%~98.7%;GS0812-4分离株N、H、F蛋白基因与疫苗株相应序列的核苷酸同源性分别为93.1%~93.8%、89.4%~90.5%、93.1%~93.8%,其推定的氨基酸同源性分别为96.4%~97.3%、89.3%~91.3%、96.4%~97.3%。由基因系统发育树可知,GS0812-4与疫苗株处于不同的分支,其中与MKY-KM08的亲缘关系最近,但GS0812-4在N、H、F 3个基因系统发育树上与其他同一毒株的亲缘关系远近不同。H、F蛋白的抗原表位预测结果表明,GS0812-4与MKY-KM08和疫苗株的抗原表位均有差异。说明GS0812-4是野毒株,与MKY-KM08属于同一基因型,来源于同一毒株,但两毒株间的H蛋白和F蛋白的抗原表位仍有差异。     

犬瘟热病毒AH株全基因组序列测定及其分子特征

本研究对犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)安徽分离株(CDV-AH株)的全基因组序列进行了测定和分析。根据GenBank上已发表的部分CDV基因组全长序列设计了8对特异性引物,RT-PCR方法分段扩增出CDV-AH株的全基因组序列。采用DNAStar软件和MEGA软件对CDV-AH株与其他CDV毒株的基因序列进行了比对和分析,并绘制系统进化树。结果显示,CDV-AH株全长15 690 bp,编码6种结构蛋白(N、P、M、F、H和L),与CDV-PS株核苷酸序列同源性最高,为98.8%,而与CDV-1以及Onderstepoort等疫苗株的序列同源性较低,为92.1%。CDV-AH株在保守区域出现15处氨基酸突变,这些突变对其所编码蛋白结构和功能的影响需要进一步研究。基于H基因序列的系统进化分析表明,CDV-AH株与其他CDV野毒株共同形成一个拓扑群,属于亚洲Ⅰ型。     

犬瘟热病毒HuN-HY171124毒株H基因的克隆与序列分析

为克隆并分析湖南衡阳分离的犬瘟热病毒(CDV)HuN-HY171124毒株H基因,采用逆转录反应合成第一链c DNA,利用巢式PCR扩增H基因全长,将PCR产物纯化克隆至T载体中构建重组载体pMD19-T-CDVHuN-HY171124-H,经序列测定,利用DNAStar和Mega等生物信息学软件进行序列分析。结果显示,CDV HuN-HY171124毒株H基因开放阅读框(OR F)为1824 bp,编码607 aa。相似性比对结果显示,该毒株与GenBank中58株分离毒株的核苷酸相似性在90.4%～98.8%之间,与弱毒疫苗毒株核苷酸的相似性均在90%左右,与我国分离的强毒株核苷酸的相似性均在98%左右。CDV HuN-HY171124毒株H蛋白第519氨基酸氨基酸为精氨酸、第549氨基酸氨基酸为酪氨酸,均为犬源CDV H蛋白特征性氨基酸。遗传进化分析发现该毒株与我国分离的大部分毒株均属于与我国分离的大部分毒株属于Asia 1型,与现有疫苗毒株不处同一个分支。CDV HuN-HY171124毒株是一株犬源CDV,其基因型属于Asia-1型,本研究扩充了CDV区域性流行病学基础数据。     

区分犬瘟热病毒Asia-Ⅰ型野毒株及疫苗株的AS-PCR方法

犬瘟热是一种接触性传染病,可侵害免疫系统、呼吸系统、消化系统,甚至神经系统,导致全身性的病理变化,对宠物犬、毛皮动物等存在巨大威胁。目前常用的胶体金检测法不能有效区分疫苗免疫与动物自然感染。为建立一种高效准确的鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的检测方法,本试验对从武汉地区收集已确诊犬瘟热的6只犬分离得到的野毒株以及3株广泛使用的CDV疫苗株进行全基因组测序,从氨基酸水平和碱基水平比对分析后,确定H基因为AS-PCR引物设计的靶基因。通过对H基因进行分型,发现武汉地区流行的CDV均为Asia-Ⅰ型,而疫苗株Y2为America-I型,疫苗株Y1和Y3均为America-Ⅱ型。对比179株Asia-Ⅰ型（6株野毒株样品+173株GenBank Asia-Ⅰ型）与3株疫苗株的CDV-H基因序列,采用AS-PCR技术（3'端错配）设计出1对能有效区分犬瘟热Asia-Ⅰ型野毒株和疫苗株的特异性引物,上游引物序列为5'-TTAAATGATAATGACATAGTG-3',下游引物序列为5'-CCTGGCAAGGCAAGA-3'。结果显示该引物有较强的特异性,6株样品野毒株均可扩增出长894 bp的片段,疫苗株不能扩增,且野毒株的H基因上存在9个较为规律的碱基（氨基酸）变异位点,而疫苗株在第277位氨基酸上均为天冬酰胺,这些变异可能导致N-糖基化位点的增加,从而对犬瘟热病毒疫苗株的毒力产生影响。本研究建立的AS-PCR方法能有效区分犬瘟热疫苗和Asia-Ⅰ型野毒株。     

犬瘟热病毒一步RT-PCR检测方法的建立

根据犬瘟热病毒(CDV)弱毒株Onderstepoort的核蛋白(N)基因的相对保守区序列设计了1对特异性寡聚核苷酸引物,在国内首次建立了CDV一步RT-PCR检测方法。该法可以特异地扩增出N基因265 bp大小的目的片段,可以检测到0.043 6μg/mL的总RNA,与两步法RT-PCR的敏感性相当。对25例犬瘟热临床疑似病例样品,一步法RT-PCR检测出17份阳性,与两步法RT-PCR的阳性符合率达94.4%,胶体金检测试纸条检测出13份阳性。研究结果表明,建立的CDV一步法RT-PCR检测方便、敏感、特异,适用于CDV临床病料的检测和分子流行病学调查。     

貉源犬瘟热病毒CDV-ZC株分离鉴定、全基因测序与分析

应用非洲绿猴肾细胞(Vero)从山东省诸城市疑似犬瘟热(canine distemper,CD)感染貉的肝脏、脾脏、肺脏等组织病料的研磨上清液中分离出1株病毒。分离株经Vero细胞传至第4代出现典型的细胞病变效应(CPE),经毒力测定、血清学、RT-PCR检测及测序、回归动物试验证明为犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV),命名为CDV诸城分离株(CDV-ZC)。采用RT-PCR方法分段克隆分离株的全基因序列并测序,测序成功的各序列依次拼接得到全基因序列并进行序列比对。结果表明,CDV-ZC株全基因(KJ994343)与标准美洲型犬瘟热强毒株A75/17核苷酸同源性高达96.5%,而与疫苗株Onderstepoort、CDV3等亲缘关系较远,同源性为91.6%~92.0%。血凝素(H)基因序列分析表明,CDV-ZC株与国内野毒株LN(13)2、GP株等以及日本野毒株UENO、HAMA等共同归属于Asia-1型,在H蛋白信号淋巴细胞激活因子(SLAM)受体结合区即542~544位增加了1个潜在N-连接糖基化位点(N-X-S/T)。致病性强毒株CDV-ZC的成功分离及全基因序列测定加深了我们对当前中国CDV流行株遗传变异情况的了解,为CD的有效预防、诊断及控制提供理论依据。     

济南市犬瘟热病毒H基因遗传进化分析

为了解济南市犬瘟热病毒(CDV)的流行情况,通过随机采集7份济南市2019年1月-6月份宠物医院疑似感染CDV的临床样品,提取病毒RNA,扩增CDV H基因全长序列,连接至载体,测序后进行H基因序列的氨基酸及核苷酸同源性分析、进化树分析、主要氨基酸位点突变分析以及H基因抗原表位预测分析.结果显示,7个野毒株均为Asia...     

狐源犬瘟热病毒的分离鉴定及H基因遗传变异分析

为分离鉴定以及分析我国毛皮动物中流行的犬瘟热病毒(CDV),本研究采用Vero-SLAM细胞从山东省荣成市某养殖场疑似CDV感染狐狸的肺脏样品中分离到1株病毒,经RT-PCR、病毒形态观察、间接免疫荧光试验、动物回归试验等鉴定,确认该分离株为CDV野毒株,命名为SD(14)7。对其H基因进行克隆和测序分析,结果表明,SD(14)7与其他Asia-1型野毒株H基因的相似性为97.1%~99.6%,其中与SD(12)1和SD(13)5的相似性最高,分别为99.5%和99.6%,与CDV强毒株He Bei株的相似性为97.8%,与疫苗株CDV3、Onderstepoort、Snyder Hill以及ConvacH基因的相似性为90.4%~90.9%。H基因系统发育树分析表明,SD(14)7株属于Asia-1型,为我国当前流行的野毒株。氨基酸序列分析显示,SD(14)7株H蛋白发生了I542N和Y549H突变,在aa542~aa544位增加了1个潜在的N-糖基化位点,潜在的N-糖基化位点数增加至10个。本研究为CDV毒力变化和宿主嗜性的研究提供了参考依据。     

犬瘟热病毒单克隆抗体的研制及胶体金试纸条检测方法的建立

本研究利用原核表达、纯化的犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)N 蛋白免疫BALB/C小鼠,成功筛选到两株分泌CDV N 蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为D3、D6。2株杂交瘤细胞分泌单克隆抗体敏感性、特异性良好,能识别不同来源的犬瘟热病毒株,单抗亚类均为IgG1。以D3作为金标抗体,D6作为检测抗体,兔抗鼠IgG作为质控线抗体,制备犬瘟热病毒胶体金检测试纸条,检测犬瘟热病毒敏感性为1000TCID50,能有效检测区分犬瘟热病毒、犬细小病毒(Canine parvovirus,CPV)、犬腺病毒2型(Canine adenovirus type 2,CAV2)、狂犬病病毒(Rabies virus,RV)。综上,本研究建立的胶体金试纸条检测方法,灵敏度高、特异性强,适用于犬瘟热病毒临床快速诊断。     

水貂犬瘟热病毒分离鉴定及其H基因序列分析

为了解山东地区水貂犬瘟热病毒(CDV)遗传变异特征,采集水貂养殖场的发病水貂病料,通过RT-PCR鉴定为CDV阳性,将阳性病料接种Vero/Dog SLAM细胞进行病毒分离,通过间接免疫荧光、电镜负染、测序等方法鉴定,得到4株犬瘟热病毒,分别命名为WD1株、WD2株、WX1株和WX2株。分离株H基因测序结果显示,WD1株、WD2株、WX1株均为Asia-Ⅰ型,其中WD1和WD2与近几年仅在水貂和狐狸养殖场流行的新犬瘟热毒株核苷酸和氨基酸序列同源性分别为97.5%~99.2%和97%~99%;WX-1型与国内犬源HL001株的同源性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99.6%和99.5%;WX2与疫苗株同属于一个分支,与疫苗毒Lederle株核苷酸和氨基酸序列同源性高达99.5%和98.8%。结果表明,水貂养殖场存在多株犬瘟热病毒混合感染的情况,提醒养殖场应注意防控,该结果也为犬瘟热病毒分子流行病学积累了资料。     

小熊猫源犬瘟热病毒株H、F基因的克隆及序列分析

为了解1株圈养小熊猫源犬瘟热病毒（CDV）GD-1的遗传变异情况,通过RT-PCR方法对该株CDV进行H、F基因的克隆、测序及序列分析。结果显示：该分离株的H基因序列与GenBank中丹麦报道的登录号为GU266280的犬源CDV毒株的核苷酸序列相似性最高,为96%;F基因序列与巴西报道的登录号为KY057355的犬源CDV的核苷酸序列相似性最高,为95.7%。下载CDV代表毒株序列进行遗传演化、氨基酸序列比对及分子特征分析。结果显示：H蛋白共有8个潜在的N-糖基化位点,分别位于19、149、309、391、422、456、587、603位点;H蛋白的SLAM受体结合位点氨基酸序列与欧亚野生型毒株一致,与疫苗株相比,530、549位氨基酸不同,与其他CDV参考毒株H蛋白相比还存在24、41等9处氨基酸位点发生明显变异,与标准强毒株A75/17的氨基酸相似性为95.2%,与Onderstepoort、Convac等5株疫苗株的氨基酸序列相似性为88.2%~89.3%;F蛋白共有6个N-糖基化位点,分别位于62、108、141、173、179、517位,与Onderstepoort等疫苗株氨基酸相似性为89.1%~89.7%;与其他参考毒株相比还存在115、130等11处氨基酸发生变异;构建基于H、F基因的遗传进化树,结果显示：该毒株位于Asia-4型的一个小的进化分支,这与目前我国流行毒株主要位于Asia-1型存在明显不同。本研究首次报道了小熊猫源的Asia-4基因型CDV野毒株,并对毒株的H及F基因进行了序列分析,对于了解我国CDV流行株的遗传变异情况、流行病学调查、疾病防控及疫苗研发等具有重要意义。