根癌农杆菌介导的深绿木霉菌T23遗传转化研究

采用根癌农杆菌介导的方法,成功地建立了丝状生防真菌深绿木霉（Trichoderma atroviride）菌株T23的遗传转化体系。并且,通过提高筛选培养基中潮霉素B的浓度和调整农杆菌的培养时间,对转化体系作了进一步的优化。转化效率约为50个突变体／10^7个分生孢子。所有转化子经继代培养5代,潮霉素B抗性筛选后,共得到118个遗传稳定的转化子。随机抽取部分转化子,进行PCR和soutllem blot分子鉴定,结果证实外源的T—DNA已经随机整合到T23的基因组中。通过形态学观察,筛选出3个在产孢量和菌丝体生长速度方面显著不同于野生型菌株T23的转化子。农杆菌介导的遗传转化方法在深绿木霉菌株T23上的成功运用,将为研究该菌的功能基因组提供强有力的工具。     

拟轮枝镰孢荧光标记与侵染结构观察

【目的】以玉米穗腐病优势病原菌和伏马毒素主要产毒菌拟轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）为研究对象,构建组成型表达绿色荧光蛋白GFP、红色荧光蛋白DsRED、过氧化物酶体靶向标记蛋白DsRED-PTS1和细胞骨架F-actin结合蛋白LifeAct-GFP的荧光菌株,观察拟轮枝镰孢侵染玉米须表皮的穿透结构,明确拟轮枝镰孢侵染结构形成的调控机制和影响因素。【方法】通过农杆菌介导的遗传转化方法将荧光表达载体p COM-GFP、p COM-Ds RED、p COM-Ds RED-PTS1和p COM-Life Act-GFP分别导入拟轮枝镰孢野生型菌株D85-2中,PCR鉴定含有目标基因的转化子,激光共聚焦显微镜观察各荧光蛋白的表达和分布;接种玉米须观察侵染结构;赛璐酚膜模拟植物表皮穿透试验,观察穿透结构和F-actin的动态组装;使用F-actin聚合抑制剂Latrunculin A、三环唑和活性氧抑制剂DPI(diphenyleneiodonium chloride)检测穿透结构形成的影响因素。【结果】建立了以遗传霉素G418为抗性标记的遗传转化方法;FV-GFP...     

生防链霉菌gCLA4遗传转化体系的建立与优化

【目的】建立生防菌淡紫灰链霉菌(Streptomyces lavendularectus)gCLA4的遗传转化体系,为定向改造基因、提高基因表达水平及其生防分子机制研究奠定基础。【方法】以具有安普霉素(Apramycin)抗性基因标记的整合型质粒pSET152为出发质粒,Escherichia coli ET12567(pUZ8002,pSET152)为供体,淡紫灰链霉菌gCLA4为受体进行接合转移试验,并对影响接合效率的培养基、热激温度、接合转移时间和筛选转化子培养基等因素进行优化。【结果】成功地将质粒pSET152转入到了生防链霉菌gCLA4中,明确了可用于筛选链霉菌gCLA4转化子的抗生素为安普霉素或四环素;链霉菌gCLA4孢子50℃热激时转化效率较高,接合效率在16,18,20h下没有明显差异,MS培养基作为接合转移培养基时转化效率最高,接合产物涂布到高氏一号抗性培养基上进行阳性转化子筛选的效果最好。【结论】建立了生防链霉菌gCLA4的遗传转化优化体系。     

Cry2A基因植物表达载体构建及其转化子生长曲线的建立

根据定向克隆原则,以pCAMBIA2301为载体骨架,Cry2A基因为目的基因,构建了大小为15354 bp的植物表达载体p2AST2301。新载体带有抗虫基因Cry2A和筛选标记基因NPTⅡ,适合通过农杆菌进行遗传转化,并以抗生素G418为筛选底物。同时将新载体转化根癌农杆菌EHA105,获得了用于植物遗传转化的工程菌,并且明确了工程菌D600 nm值在1.0-1.6之间活力最强。     

刺激植物响应蛋白基因Epl1的载体构建及酵母转化

[目的]构建刺激植物响应蛋白Epll基因的真核表达载体,筛选多拷贝酵母转化子.[方法]以深绿木霉（Trichoderma atroviride）ACCC30153的cDNA为模板进行PCR获得Epl1基因片段,并将目的片段插入表达载体pPIC9K的相应位置,获得重组表达载体,并将pPIC9K-Epl1转入毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中,并用不同中终浓度的遗传霉素G418筛选多拷贝重组酵母菌株.[结果]对重组载体进行PCR及双酶切检测为阳性;在含有终浓度为2 mg/ml遗传霉素G418的YPD平板上筛选得到7株多拷贝的转化子GS115-Epl1,经PCR鉴定1株转化子呈阳性.[结论]Epl1基因的我体构建及多拷贝酵母转化子筛选为以后大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定基础.     

农杆菌介导遗传转化云蔗05-51

【目的】建立云蔗05-51组培再生体系明确其对抗生素G418的耐受性,为云蔗05-51基因工程遗传改良提供参考。【方法】以云蔗05-51心叶为外植体,MS基本培养基添加2, 4-D、6-BA和KT,设置质量浓度梯度及不同激素配比,诱导愈伤组织及其分化植株。在云蔗05-51胚性愈伤组织增殖与不定芽分化阶段,培养基中添加不同含量的G418,确定合适的G418筛选质量浓度。以nptⅡ为标记基因,农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织,筛选获得抗性植株,PCR和NPTⅡImmunoStrip检测确定nptⅡ基因的整合与表达。【结果】云蔗05-51愈伤组织诱导与增殖阶段,适宜的培养基配方为MS基本培养基添加3.0 mg/L 2, 4-D;愈伤组织分化不定芽阶段宜采用MS基本培养基添加1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。云蔗05-51对G418耐受性筛选结果显示:愈伤组织增殖阶段和分化不定芽阶段G418的适宜筛选质量浓度分别为40和20 mg/L。G418抗性植株PCR检验表明:标记基因nptⅡ已成功整合到云蔗05-51转基因植株基因组中;NPTⅡImmunoStrip检测表明:nptⅡ的蛋白水平得以表达。【结论】建立了云蔗05-51心叶组培再生体系,明确了40和20 mg/L G418是筛选抗性愈伤和抗性植株的适宜质量浓度。建立了农杆菌介导遗传转化云蔗05-51胚性愈伤组织系统,为有益基因导入甘蔗品种提供了参考。     

法夫酵母整合型表达载体的构建

为了建立法夫酵母虾青素代谢途径研究和分子育种的技术体系,构建了法夫酵母的整合型表达载体.通过测定法夫酵母对G418的抗性来确定抗性筛选物的质量浓度,以来源于法夫酵母本身的rRNA基因为基因同源重组片段,利用法夫酵母肌动蛋白启动子和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（gpd）启动子,构建了携带G418抗性基因的整合型载体pMD-18spakta和pMD-18spgktg.结果表明：法夫酵母对20 μg/mL质量浓度的G418敏感,将构建的载体转化法夫酵母菌株后,筛选得到了能够在含有G418的培养基上生长的转化子;利用PCR的方法检测到转化子中存在的抗性基因.将筛选得到的阳性菌株连续传代培养10次后,发现该菌株的G418抗性仍然存在;以总DNA为模板,用PCR的方法仍可检测到G418抗性基因.说明已经构建得到了遗传稳定性良好的法夫酵母整合型表达载体,构建的质粒pMD-18spakta和pMD-18spgktg可作为法夫酵母整合载体应用于法夫酵母的DNA重组实验.     

枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白表达载体的筛选

【目的】筛选适合枸杞内生真菌（Fusarium nematophilum）NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的表达载体,为后期研究该菌株在宿主植物中的侵染行为和定殖规律奠定基础。【方法】采用PEG介导原生质体转化法,分别将GFP标签蛋白表达载体pFL2、pDL2、r-KNT和KNTG转入NQ8GⅡ4菌株,对比4种NQ8GⅡ4转化子的荧光强度、遗传稳定性、拮抗活性和致病性,筛选GFP标签蛋白的最佳表达载体。【结果】枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株对潮霉素B（HmB）的耐受质量浓度为20 mg/L,对遗传霉素（G418）的耐受质量浓度为80 mg/L。通过PEG介导原生质体转化,获得pFL2转化子272株、pDL2转化子57株、r-KNT转化子73株和KNTG转化子226株,其转化效率分别为13.60,2.85,3.65和11.30株/μg。荧光显微观察发现,表达载体pDL2和KNTG的转化子所产生的荧光强度明显强于表达载体r KNT和pFL2的转化子。连续培养5代后,pDL2转化子的遗传稳定率高达89.47%,pFL2、r-KNT和KNTG转化子的遗传稳定率分别仅为67.28%,68.49%和58.85%。4种转化子对枸杞胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）的拮抗活性以及对枸杞离体叶片的致病性均与野生型菌株无明显差异。【结论】pDL2更适合用作NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的表达载体。     

基于无缝克隆方法构建毛木耳多功能纤维素酶基因农杆菌转化载体

【目的】构建毛木耳农杆菌介导转化双元表达载体,为毛木耳后续多功能纤维素酶基因Mfc转化研究奠定基础。【方法】通过EcoR I酶切p PK2质粒并回收大片段,应用实验设计引物分别对扩增毛木耳Gpd启动子、Mfcsg基因、intron、Hpt基因,通过无缝克隆方法,将p PK2质粒大片段与表达序列同源组装,分别构建农杆菌转化载体pAKMFC、pAKIMFC。【结果】测序验证发现各个元件都已在改造后的载体中进行了正确组装,符合实验预期。【结论】本实验通过毛木耳Gpd启动子、Mfcsg、Hpt潮霉素B抗性基因和终止子组装,构建形成了能够应用于毛木耳农杆菌介导转化的多功能纤维素酶基因双元表达质粒p AKMFC和p AKIMFC,为多功能纤维素酶Mfcsg基因转化增强毛木耳纤维素降解能力奠定了基础。     

绿色荧光蛋白在贵阳腐霉的组成性表达

以潮霉素抗性基因hph为筛选标记,以双元载体pPK2为基本骨架,将增强型绿色荧光蛋白基因egfp置于组成型启动子PgpdA和色氨酸C终止子TtrpC之间,构建了组成性表达egfp的载体pPK2EGFP,利用根癌农杆菌介导的遗传转化法,转入贵阳腐霉(Pythium guiyangense)表达.对转化子进行RT-PCR和荧光显微镜检测,结果表明,egfp基因在贵阳腐霉转化子中能稳定表达.     

沙门菌、巴氏杆菌和大肠埃希菌多重PCR检测方法的建立

旨在建立一种可以应用于临床样本同时检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌感染的多重PCR方法。根据NCBI上已收录的沙门菌hut基因、多杀性巴氏杆菌 kmt1基因和大肠埃希菌23SrRNA基因的全基因序列,设计并合成3对特异性引物,通过优化多重PCR反应条件,建立能够同时检测3种细菌混合感染的多重PCR诊断方法。特异性分析表明,应用该方法可以从沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌以及3种细菌的混合物中扩增出3条大小分别为286 bp、457 bp和652 bp的特异性条带,其他对照组检测结果均为阴性;敏感性分析表明,该方法对沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的最低检出量分别为1.77×10　、1.99×10　、2.01×10　 CFU/mL;人工模拟感染样本检测表明,该方法能从混合感染的病料中检测出3种病原菌。可见：所建立的多重PCR方法具有特异性强,敏感度高,稳定性好的特点,可以有效检测沙门菌、多杀性巴氏杆菌和大肠埃希菌的混合感染。     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

兰州百合和有斑百合的核型研究

【目的】研究兰州百合及有斑百合的染色体核型。【方法】利用染色体常规压片的方法,对兰州百合和有斑百合的染色体数目及核型进行了研究和分析。【结果】兰州百合的核型公式为2n=2x=24=2m+2sm+6st+14t,相对长度为6.35%～12.07%,核型不对称系数为83.25%,染色体相对差异较大。有斑百合的核型公式为2n=2x=24=4m+12st+8t,相对长度为6.11%～12.90%,核型不对称系数为80.11%。【结论】兰州百合的核型类型属于3A型,有斑百合的核型类型为3B型,以有斑百合核型的进化较高,可见不同居群的百合间核型存在差异。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

加州新小绥螨对截形叶螨的捕食作用

为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus(McGregor)对截形叶螨Tetranychus truncate(Ehara)的捕食潜力,采用捕食者功能反应方程及参数研究加州新小绥螨对截形叶螨各螨态捕食作用。结果表明,加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.365、1.276和1.390。在不同温度条件下,加州新小绥螨对截形叶螨的功能反应均属于HollingⅡ型;对猎物卵和幼若螨的控制能力最强。在试验温度范围内,加州新小绥螨的捕食能力随温度升高呈先增后减趋势,28℃时最强,对截形叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数(a)最大,分别为0.639、0.730和0.842;处理时间最短,分别为0.126、0.075和0.039d;最大日捕食量分别为7.943头、13.405头和25.575粒。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰反应,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低,捕食作用率与其自身密度的关系为E=0.423P-0.747。     

美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia的wsp基因分子检测及系统发育分析

【目的】对美洲棘蓟马体内共生菌Wolbachia进行分子生物学鉴定,确定该蓟马体内Wolbachia的进化位置,为进一步探讨Wolbachia对其生殖作用的调控机制提供理论依据。【方法】以wsp基因为目的基因,对美洲棘蓟马体内的共生菌Wolbachia进行特异性扩增和测序,使用Clustal X 1.83软件对所得DNA序列进行比对;在MEGA 4.0软件中采用邻接法对Wolbachia的系统发育关系进行分析。【结果】利用wsp基因的特异性引物从美洲棘蓟马体内扩增出了632 bp的Wolbachia的wsp基因片段(GenBank登录号为JN315668),580 bp的Wolbachia A群的wsp基因片段和405 bp的Mel亚群的wsp基因片段。系统发育分析结果表明,美洲棘蓟马体内的Wolbachia与黑腹果蝇亲缘关系较近。【结论】美洲棘蓟马体内感染的Wolbachia属于A群Mel亚群。     

Pina新等位变异Pina-D1o的分离及分析

Puroindoline基因(Pina和Pinb)是控制小麦籽粒硬度的主效基因,决定小麦加工品质,分离该基因的新等位变异有利于小麦籽粒硬度性状的改良。采用同源克隆方法从节节麦(Aegilops tauschii,DD PI603224)中分离到一个Pina新等位变异Pina-D1o。生物信息学分析表明,该基因编码区全长447bp,编码148个氨基酸残基,具有小麦族作物PinA蛋白所特有的WRWWKWWK色氨酸结构域和10个半胱氨酸所形成的5个二硫键结构。根据核苷酸序列构建的拓扑树,Pina-D1o与Pina-D1m、Pina-D1n相同,均由功能性等位变异Pina-D1a发生单基因突变而来,因而Pina-D1o有可能来源于Pina-D1a。可见,新等位变异类型PinaD1o的发现可以为小麦的籽粒硬度改良提供基因资源。     

山葡萄C4H基因的克隆表达及遗传转化分析

通过生物学技术来研究C4H基因在山葡萄着色过程中的作用,进而揭示山葡萄果皮着色的分子机理;利用RT-PCR技术克隆了山葡萄C4H基因的全长cDNA序列,并对该蛋白进行生物信息学分析,预测其功能;利用实时荧光定量PCR检测C4H基因在山葡萄8个不同转色时期的表达量,将克隆获得的山葡萄C4H基因完整的ORF连接到原核表达载体pET28a上,转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3),并通过不同浓度的IPTG诱导表达, SDS-PAGE检测表达产物.为了验证山葡萄C4H基因的功能,构建了表达载体pC C4H并转化农杆菌GV3101.用菌液浸泡花序法对拟南芥进行遗传转化,在含50 mg/L Kan的培养基上对T_0代种子进行筛选.克隆获得的山葡萄C4H cDNA全长1 735 bp,开放阅读框1 518 bp,编码505个氨基酸,该基因表达产物分子质量为57.70 KDa,等电点值9.06.C4H基因在山葡萄果皮转色各个时期均存在表达;该基因原核表达产物与预期大小一致,表明原核表达成功,拟南芥遗传转化先后得到3个阳性幼苗.对移栽成活的2株抗性植株进行PCR检测为阳性, 2株叶片颜色均变成紫红色;经花色素苷质量浓度的测定表明其质量浓度比对照组植株高出3倍.在拟南芥中花色素苷质量浓度虽然较低,但还是能少量合成,说明其花色素苷生物合成途径是开通的,只是积累的量较少.     

结球甘蓝类钙调蛋白基因 CML48和 CML50在不同胁迫下的表达分析

为探究结球甘蓝类钙调蛋白（CMLs）响应不同胁迫时的功能,丰富CMLs参与钙信号网络调控,为CMLs参与植物逆境途径及其功能的研究提供依据。以结球甘蓝ZG为材料,克隆得到 CML48和 CML50基因,序列分析表明 CML48开放阅读框（ORF）为672 bp,含4个内含子,编码223 aa,分子量为25.28 ku; CML50开放阅读框ORF为1 095 bp,编码364 aa,分子量为38.06 ku,含3个内含子;均为亲水蛋白,均含有2个EF-hand结构域;系统发育树表明 CML48和 CML50均与甘蓝处于同一进化枝,与白菜、油菜的亲缘关系最近。qPCR表明 CML48和 CML50在干旱(PEG6000)、盐胁迫(NaCl)、低温(4 ℃)、高温(37 ℃)、H₂O₂、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等不同胁迫处理下,在叶和根中的表达均有上调,且 CML50的表达量均显著高于 CML48, CML48在茎尖中高度响应高温胁迫,而在根中不响应高温和H₂O₂胁迫。初步说明 CML48和 CML50在根和叶中均可响应上述8种非生物胁迫。     

牙鲆变态发育过程中epigen基因的空间表达分布

细胞分裂在鲽形目鱼类变态过程中发挥了重要作用。Epigen作为表皮分裂原,通过激活MAPK通道来调控有丝分裂。以前的研究利用定量PCR表明,epigen在变态前期表达量升高,而变态后期表达量下降,表明其与变态发育相关。为了进一步调查epigen与牙鲆变态发育的关系,利用RNA整体原位杂交技术检测了epigen在变态期牙鲆体内的空间表达分布,发现在变态期的各个阶段,epigen基因表达分布均比较广泛,表皮、鳃、肝脏、肠道、鳍条、支鳍骨、肌节等组织都有表达,在牙鲆变态前和变态早期(E期)信号较强,而在变态高峰期(F期和G期)和变态后期(H期)信号逐渐变弱。Epigen空间表达分布模式提示,其作为表皮分裂原,可能广泛参与牙鲆变态发育早期事件,尤其可能与肝脏、肠道、支鳍骨和鳍条的发育有关。