猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NSl基因的克隆与原核表达

根据猪细小病毒 (porcineparvovirus ,PPV)NADL 2株非结构蛋白基因NS1序列设计引物 ,扩增出了PPVSY 99株的NS1基因 ,将其克隆到原核表达载体pET2 8a中 ,得到重组质粒SYNS1/pET2 8a。将SYNS1/pET2 8a转化到大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导 ,使PPVNS1基因获得了表达 ,运用ELISA和Westernblotting证实了表达产物的特异性。经表达产物细胞定位分析 ,表达的NS1蛋白是以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变诱导时间或诱导剂IPTG的浓度 ,确定了表达NS1蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 .6mmol·L-1,诱导时间为 3h ,在大肠杆菌中最高表达含量为 17.8%。亲和层析后 ,得到了纯化的NS1蛋白 ,在Westernblotting检测中 ,纯化蛋白大大降低了反应背景。表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂来检测PPV的发生 ,而且还可用于鉴别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪     

猪细小病毒NS1蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

【目的】建立一种快速检测猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）野毒抗体的方法。【方法】参照已发表的PPV基因组（AY502114.1）序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增PPV-NS-1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化BL21（DE3）表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。以该蛋白作为诊断抗原,经过对间接ELISA条件的优化,建立检测PPV抗体的NS1-ELISA诊断方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行检测。用建立的PPV NS1-ELISA诊断方法和血凝抑制试验（HI）同时对临床送检的306份血清样品进行检测,比较二者的符合率。【结果】成功扩增了870 bp的NS1基因部分片段,构建了pET30a-NS1原核表达载体,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒抗体的NS1-ELISA诊断方法。该方法与猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙脑病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）等7种常见猪病病毒的阳性血清均不发生反应;该方法检测敏感性为1∶12 800;批内重复性试验和批间重复性试验中样品的变异系数分别小于5%和10%。PPV NS1-ELISA检测方法与HI的符合率为96.2%。【结论】制备了NS1重组蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,以其作为包被抗原建立的PPV NS1-ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PPV的快速诊断和流行病学调查等提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

[目的]为建立猪细小病毒的快速诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上猪细小病毒基因组序列和原核表达质粒pET30a(+)多克隆位点序列设计1对引物,应用PCR技术扩增出猪细小病毒SD1株NS1基因全序列,对阳性重组质粒进行测序和同源性比较。构建原核表达重组质粒pET 30a/NS1,并在大肠杆菌中进行诱导表达。[结果]通过PCR扩增获得2 208 bp目的片段。所克隆NS1基因与已报道的PPV相应基因的核苷酸同源性为97.3%~99.4%,表明NS1基因具有高度保守性,但在偏3′端连续缺失12个碱基。所克隆的PPVNS1基因在原核细胞中成功表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。[结论]SDS-PAGE检测结果表明PPVNS1蛋白的分子量为86 kD。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

为研究猪细小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）NS1基因，建立快速、准确诊断猪细小病毒的方法，减少猪细小病毒造成的损失，笔者克隆了含有NS1基因的片段，并且与已登录猪细小病毒的相应序列进行比较，成功构建了原核表达重组质粒PET 30a／NS1，并在E.coli中进行了诱导表达。     

猪细小病毒自然弱毒N株非结构蛋白NS1基因原核表达

为进一步探讨猪细小病毒自然弱毒N株（PPV-N株）的分子病原学机理,根据GenBank上已发表的PPV全基因组序列（登录号NC_001718）设计1对引物,通过PCR方法扩增获得PPV-N株NS1全长基因,将其克隆到pMD18-T载体上,进而构建原核表达重组质粒pET32a-NS1,并在BL21（DE3）pLysS中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE电泳显示NS1在大肠杆菌中得到成功表达,重组蛋白大小约为90.0 kDa;Western blotting分析表明,该蛋白能与PPV阳性血清发生特异性反应,证明该蛋白具有良好生物学活性。NS1在大肠杆菌中成功表达,且具有免疫原性,可作为PPV临床鉴别诊断抗原。     

日本脑炎病毒WHe株NS1基因的克隆、测序及表达

以日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)WHe株的基因组RNA为模板,采用RT-PCR技术,克隆了JEV WHe株的NS1基因,并对其进行了测序和序列分析。构建了pET28b-NS1表达载体,转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3),并对其进行了诱导表达,对表达产物进行检测。结果表明,NS1基因全长1 145 bp,其核酸序列与JEV P3株同源性为99．4％,与SA14和SA14-14-2等27个JEV毒株的核苷酸序列同源性为98％,表明NS1基因的保守性很高;pET28b-NS1表达产物的相对分子质量约为43 ku,大小与预期结果相符。NS1基因克隆表达成功。     

Expression and Activity Analysis of Non-Structural Protein 2 （NS2） of Bombyx mori Densovirus Zhenjiang Strain

The gene of the non-structure protein 2 （NS2） was cloned by PCR from the genome ofBombyx mori densovirus Zhenjiang strain （BmDNV-Z）, inserted into prokaryotic expression vector pET28a to construct recombinant plasmid pET28a-NS2 and then expressed in bacteria Escherichia coli BL21 （DE3）. The expressed recombinant protein was identified by SDS-PAGE and Western blot analysis. Then, the recombinant protein was purified by Ni-NTA column, renatured and tested for enzyme activities. The purified NS2 protein exhibited a helicase activity unwinding double-stranded DNA substrates into single-strand primers, and higher unwinding activity to polarity substrate. Similarly, the purified NS2 protein possessed an ATPase activity and its enzyme activity was 0.276 μmol gg^-1 h^-1 in this study. The results indicated that the non- structure protein which encoded by the gene of BmDNV-Z NS2 possesses the biological activities of helicase and ATPase, and the helicase prefers to polarity substrates. Based on these results, it is speculated that the gene of BmDNV-Z NS2 plays an important role in the viral DNA replication.     

家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2(NS2)的表达及活性研究

 【目的】对家蚕浓核病毒镇江株非结构蛋白2（NS2）基因进行克隆、表达,并测定表达产物的生物活性。【方法】利用PCR技术从家蚕浓核病毒镇江株（BmDNV-Z）基因组中扩增得到非结构蛋白2(NS2)基因片段,将其克隆到表达载体pET28a得到重组表达质粒pET28a-NS2,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达,SDS-PAGE和Western blot检测,表达产物经Ni柱纯化,经过复性检测其Helicase和ATPase活性。【结果】克隆获得了BmDNV-Z NS2基因,并在大肠杆菌中得到了成功表达,表达产物经Ni柱纯化获得了目的蛋白NS2。纯化的NS2蛋白具有Helicase活性,能将双链DNA底物解旋成为单链,并且具有一定的底物极性选择性,对于极性底物表现出更高的解旋活性。同时,纯化的NS2蛋白具有ATPase活性,其酶活力可达到0.276 μmol?μg-1?h-1。【结论】BmDNV-Z NS2基因编码的病毒非结构蛋白具有Helicase和ATPase活性,并且Helicase活性具有一定的底物极性选择性,推测该基因在病毒DNA的复制过程中发挥重要作用。     

NS2A序列对日本脑炎病毒NS1基因在原核系统中的体外表达的影响

 用RT-PCR扩增并克隆了日本脑炎病毒弱毒株SA14-14-2的NS1、NS1'、NS1-2A的 cDNA片段,分别将其亚克隆到原核表达载体pET-30b(+),构建了重组原核表达质粒pET30b-NS1、pET30b-NS1'、pET30b-NS1-2A,转化大肠杆菌BL-21(DE3),用IPTG诱导培养。结果表明,仅有pET30b-NS1质粒转化的菌株获得表达,而另外2种重组质粒转化的菌株均无表达。表达的融合蛋白分子量约为46kD,约占菌体总蛋白的30.8%,Western blotting分析表明表     

猪细小病毒YL株序列分析及其 VP2基因原核表达

为对猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)进行分子生物学研究,将该病毒YL株基因组分为4个重叠片段进行PCR扩增,并将扩增产物克隆到pGEM-T载体中,测定病毒基因组全长序列。另外,应用其中1对引物,通过PCR方法扩增出一段包含VP2主要抗原区域的片段,构建重组质粒pET-VP2,IPTG诱导表达。序列分析结果表明,PPV YL株和国内外PPV分离毒株NS1基因核苷酸同源性为97.8%～99.4%,氨基酸同源性为96.7%～99.5%,与国内外主要毒株VP2基因核苷酸同源性为98.7%～99.7%,氨基酸同源性为97.4%～99.8%。进化树分析表明,PPV YL株与BQ株(EU790641)毒株处在同一分支上,遗传距离最近。SDS-PAGE结果显示,表达产物分子质量为56ku,经Western blotting检测具有生物学活性。     

TeiR融合蛋白分离及多克隆抗体的制备

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)基因组DNA,PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pET28a中,经酶切验证后获得teiR基因表达载体pET28a-teiR.将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,添加终浓度为1 mmol.L-1的IPTG进行诱导,提取细菌总蛋白进行蛋白的SDS-PAGE电泳.并根据融合蛋白特性,利用Ni-NTA Spin Column对TeiR融合蛋白进行分离纯化,经分离纯化后的重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出单一条带.进一步以获得的TeiR融合蛋白为抗原,制备兔抗TeiR多克隆抗体,经ELISA测定该抗体的效价为1∶10000,该抗体与睾丸酮丛毛单胞菌天然TeiR蛋白反应良好,说明该抗体特异性良好.     

鱼类病毒性出血性败血症病毒核蛋白基因的原核表达

通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)获得编码病毒性出血性败血症病毒(Viral hemorrhagic septicemia virus,VHSV)核蛋白基因,将其克隆至原核表达载体pET28a,并在E.coli BL21(DE3)中得到表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定。结果表明,通过RT-PCR扩增获得长度为1 221bp核蛋白基因片段,诱导表达重组质粒pET28a-N,经SDS-PAGE检测,IPTG终浓度为1mmol/L时,诱导5h蛋白表达量最高,获得的目的蛋白大小与N蛋白的预测分子质量一致,约为48ku。诱导后的菌液进行超声波破碎后,将沉淀和上清分别用于SDS-PAGE电泳,结果表明目的蛋白主要以包涵体的形式存在。表达蛋白经过复性、纯化,得到了较高纯度的可溶性蛋白。经Western-blot检测表明,该表达产物能被羊抗VHSV阳性血清特异性识别。     

拟南芥叶绿体血红素加氧酶AtHO1基因的克隆和多克隆抗血清制备

为研究叶绿体血红素加氧酶HO1的生物学功能和分子作用机制,构建了拟南芥血红素加氧酶基因AtHO1的重组融合蛋白表达载体pET28a-AtHO1,质粒转化到Escherichia coli BL21(DE3)中诱导表达重组蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,AtHO1的重组融合蛋白获得了高效表达,分子质量为28～36ku,且为可溶蛋白。重组蛋白经Ni-NTA亲和层析法纯化后,得到纯度较高的蛋白。纯化产物免疫新西兰大耳兔获得了专一识别重组蛋白6×His-AtHO1的抗血清,进一步提取拟南芥和水稻叶片总蛋白,蛋白质印迹检测显示,在分子质量28～36ku之间出现特异性条带,证明用重组蛋白6×His-AtHO1制备的多克隆抗血清可以与拟南芥和水稻HO1蛋白特异性结合,说明拟南芥HO1的抗血清能够用于水稻HO1的功能分析和应用研究。     

捻转血矛线虫Hc38重组蛋白的表达纯化及抗原性鉴定

[目的]通过表达和纯化捻转血矛线虫新功能基因He38最大开放阅读框ORF1,确定完整的Hc38蛋白天然表达形式、分子量大小和免疫学活性鉴定,为研究该基因功能和基因工程应用奠定基础.[方法]参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的He38基因序列(AY594263)设计引物,PCR扩增目的基因并克隆到表达载体中,重组表达载体转化大肠杆菌后IPTG诱导表达,SDS-PAGE和薄层扫描检测分析表达产物,通过亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western bloting和ELISA方法检测其抗原性.[结果]Hc38基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白相对分子量约为68 KD,表达量占菌体蛋白总量的30;,亲和层析柱纯化出目的蛋白,并能被捻转血矛线虫病绵羊阳性血清和重组表达产物免疫小鼠血清识别,具有反应原性.[结论]实现了Hc38基因的原核表达和纯化,验证了Hc38基因在虫体内的表达形式和抗原性.     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

丁香假单胞菌极毛蛋白hrpA基因的克隆与表达

将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.     

香蕉条斑病毒CP区基因的克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

依据锌指结构在BSVCP上的可能位置合成了2条引物,通过PCR扩增得到长约640 bp的目的片段;将目的片段与质粒pET28 b(+)连接,构建了含BSVCP区基因的融合蛋白原核表达载体pET28b-BSVCP;克隆测序以确定其阅读编码框的正确性,然后用正确的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),并诱导表达;经IPTG诱导后,出现一特异的约30 kDa融合蛋白质表达条带。     

口蹄疫3D蛋白N端T细胞表位重组蛋白的表达、纯化及鉴定

为获得具有抗原性的口蹄疫病毒(FMDV)3D蛋白N端T细胞表位的重组表达蛋白,根据FMDV3D蛋白前115位氨基酸序列,设计优化并人工合成相应的核酸序列,将其克隆至pET-28a中,构建原核表达质粒pET28a-115,并将重组质粒转化至BL21(DE3)细胞。经IPTG诱导后,收集菌液进行SDS-PAGE和Western-bolt鉴定,结果显示,在16kD处有一条明显的蛋白表达条带。对表达产物进行可溶性分析,结果表达蛋白50%为可溶性蛋白,经Ni-NTA亲和层析纯化后获得了较高浓度和纯度的目的蛋白。研究结果表明,含FMDV 3D蛋白前115位氨基酸的重组蛋白在大肠杆菌中得到了高效可溶性表达,并具有较好的抗原活性,为开发口蹄疫诊断试剂和基因工程疫苗奠定了基础。     

SARS病毒S蛋白S1和S2片段的合成及在大肠杆菌中的表达

[目的]通过拼接完成对SARS S蛋白的上下游序列S1和S2的合成,并在大肠杆菌中表达,获得具活性的S1和S2蛋白。[方法]利用不对称PCR方法以及采用设计酶切位点将2个片段连接的方法合成SARS香港株S蛋白上下游2个片段S1和S2;构建S1和S2这2个基因片段的原核表达载体,pET28a-S1和pET28a-S2,并转化BL21表达菌株,然后用IPTG诱导目的基因的表达并提取纯化目的蛋白。[结果]连接得到S1和S2这2个基因片段,并成功地在大肠杆菌中得到表达。[结论]该研究为后续SARS疫苗研究提供检测抗原奠定了基础。