睾丸酮丛毛单胞菌ATCC 11996类固醇脱氢酶3α-HSD的高效表达与纯化

利用分子克隆的方法扩增与克隆睾丸酮丛毛单胞菌ATCC 11996的3α-HSD基因,构建以pET-15b为载体的表达工程菌,IPTG诱导蛋白表达,通过优化表达菌的最佳表达条件得到最大表达量的目的蛋白.诱导后将工程菌裂解,通过硫酸铵沉淀,Ni-NTA亲和层析,分子筛分离进行纯化,并测定纯化后蛋白的酶活性.结果表明:1)克隆获得了睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因并实现了异源表达;2)工程菌的最佳表达条件为:37℃培养,0.6mmol/L IPTG诱导4h,培养基中Zn2+终浓度为0.1 mmol/L;3)表达工程菌裂解后用60％硫酸铵沉淀,亲和层析和分子筛分离后得到了纯度高达99％的目的蛋白,纯化后的蛋白保持酶活性.本试验成功克隆表达了睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD基因,建立了3α-HSD的高效表达与纯化方法,为相应抗体的制备与水资源中的类固醇激素检测方法的建立提供基础.     

西尼罗河病毒E蛋白结构域Ⅲ基因的原核表达

根据已发表的西尼罗河病毒(WNV)的DNA序列设计合成一对特异性引物,用聚合酶链式反应(PCR)扩增E蛋白结构域Ⅲ(E-DⅢ)的基因.将PCR产物克隆至pET28a原核表达载体上,获得重组表达质粒pET28a-E-DⅢ.将该质粒转化BL21(DE3),经IPTG诱导后提取包涵体,纯化融合蛋白,通过SDS-PAGE和Western blot方法证实E-DⅢ的基因可以在大肠杆菌中高效表达.     

稻褐飞虱羧酸酯酶基因的克隆与表达

以稻褐飞虱的cDNA为模板,进行PCR扩增,获得约1 900 bp的DNA片段.通过T-A克隆,将PCR产物插入pMD18-T载体中.再以此重组载体为模板,以羧酸酯酶成熟蛋白基因(cae-M)的特异性引物进行PCR扩增.将cae-M扩增产物和pET28a分别用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,酶切产物纯化后在T4连接酶作用连接成重组表达载体pET28a-cae-M.将pET28a-cae-M转化BL21(DE3),经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约62 kD外源蛋白带.蛋白质印迹分析表明,该外源蛋白与6×His融合表达.     

BLCAP蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

目的:利用原核表达系统表达BLCAP融合蛋白并制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a( )-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达并采用亲和层析的方法纯化和SDS-PAGE鉴定后免疫日本大耳白兔,制备BLCAP蛋白多克隆抗体并检测其特异性。结果:经过IPTG诱导,获得分子量大小约为28ku的融合蛋白,用纯化得到的融合蛋白免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP蛋白的多克隆抗体,通过Western blot检测证明该抗体能够与BLCAP融合蛋白发生特异性结合。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性,制备的抗BLCAP的多克隆抗体特异性较好,为今后进一步研究BLCAP蛋白性质与功能奠定了基础。     

球孢白僵菌CDEP2基因原核表达、蛋白纯化及多克隆抗血清制备

类枯草杆菌蛋白酶是昆虫致病真菌重要的毒力因子,利用合成的特异性引物通过RT-PCR扩增了球孢白僵菌类枯草杆菌蛋白酶CDEP2基因.将其与质粒pET28a连接,构建重组原核表达载体pET28-CDEP2,转化大肠杆菌BL21(DE3),并用IPTG进行诱导表达.SDS-PAGE检测His-CDEP2融合蛋白以包涵体方式大量表达并对其进行纯化.用SDS-PAGE分离纯化的CDEP2蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗血清.Western blotting免疫印迹检测分析表明,该抗血清对CDEP2蛋白有特异性识别能力,可用于对CDEP2蛋白功能的进一步研究.     

柑桔黄龙病菌外膜蛋白的原核表达与纯化

为获得大量高纯度的柑桔黄龙病菌Omp 外膜重组蛋白、应用PCR 方法从染病柑桔模板中扩增出黄龙 病菌omp 基因的3 个片段、将其克隆到pMDl9-T 载体、再亚克隆到pET32a 原核表达载体、构建pET32a-omp 原核表 达重组质粒、然后转化大肠杆菌BL21（DE3）、经IPTG 诱导并用SDS-PAGE 电泳检测带组氨酸标签的Omp 融合蛋白 表达后、用镍柱分离纯化该融合蛋白。结果表明院柑桔黄龙病菌omp 基因序列的两个片段在37益经1 mmol/L IPTG 诱导后、在大肠杆菌得到了高效表达;镍柱纯化蛋白得到预期大小（约55 ku）的融合蛋白。     

猪肺炎支原体脂蛋白LppT的多克隆抗体制备及鉴定

试验构建猪肺炎支原体重组表达质粒pET30a-LppT,通过快速定点突变试剂盒将LppT基因中513、945、1 860、2 547 bp处的A突变为G,使改造后的LppT基因能在大肠杆菌系统中正确表达,IPTG诱导重组蛋白的表达并进行了蛋白纯化,纯化的目的蛋白与佐剂混合、乳化制备免疫原,免疫新西兰大白兔制备LppT蛋白多克隆抗体。SDS-PAGE分析结果显示,IPTG诱导表达后获得1条特异性蛋白条带,分子质量约为110 ku,与预期蛋白大小一致。可溶性分析结果表明目的蛋白以可溶形式表达于上清中,纯化的蛋白经SDS-PAGE分离后,用制备的LppT多克隆抗体进行Western Blot检测,结果表明制备的LppT多克隆抗体具有较强的特异性。     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

猪带绦虫六钩蚴HSP的克隆和表达

提取猪带绦虫激活和未激活六钩蚴总RNA,RT-PCR扩增HSP目的基因,将目的基因与pGH克隆载体连接,经酶切鉴定后,将阳性重组质粒进行测序,结果扩增出激活的六钩蚴的目的片段。将目的基因亚克隆到原核表达载体pET-28a-HSP中,并将获得的pET28a-HSP阳性重组子转化至宿主菌E.coliBL21,IPTG进行诱导表达,并对重组抗原pET-28a-HSP进行SDS-PAGE和Western-blot检测。结果表明重组经SDS-PAGE分析可见一条约35 kDa大小的融合蛋白条带的抗原,Western-blot结果显示其能被囊虫病人阳性血清识别。这将为进一步阐明六钩蚴入侵中间宿主的机理、设计新型抗猪囊虫病和绦虫病疫苗打下基础。     

猪瘟病毒E2糖蛋白主要抗原域的原核表达及纯化

本实验利用PCR方法从pUC18-E2上扩增出E2基因的主要抗原域片段,长为601 bp,将该PCR产物克隆到原核表达载体pET32a上,得到pET32a-e2重组质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导重组蛋白表达,SDS-PAGE和Western blot检测蛋白表达,目的蛋白以包涵体形式表达,其分子量42KD左右;Ni亲和层析柱纯化融合蛋白,并通过Western blot检测.pET32a-e2重组子的构建及蛋白表达与纯化为进一步制备多克隆抗体或单克隆抗体打下了基础.     

新型番鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其抗原特性

新型番鸭呼肠孤病毒是近年来新发现的一种引起鸭严重疾病的病原,该病毒与经典MDRV主要在病毒宿主范围、体外培养特性、临床致病性和免疫保护特性上存在显著的差异。通过RT\|PCR扩增新型呼肠孤病毒σC基因,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切处理,插入到pET\|28a（+）原核表达载体,获得重组质粒pET\|28a（+）\|σC。将重组阳性质粒转化至BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达后经SDS\|PAGE电泳对σC蛋白进行初步分析,蛋白分子量约为36 kDa。重组蛋白经纯化后免疫实验兔,获得抗σC蛋白的高效免疫血清。通过Western Blot与间接免疫荧光实验初步表明,新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白具有良好的反应活性。     

鱼类神经坏死病毒衣壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌外膜蛋白ompN1融合基因的原核表达

目前在针对鱼类神经坏死病毒的疫苗研究中，主要是将神经坏死病毒某些蛋白作为抗原进行注射免疫，但是传统的注射免疫并不能有效地激发黏膜免疫。笔者将鱼类神经坏死病毒的衣壳蛋白（MCP）与鮰爱德华氏菌的跨粘膜蛋白ompN1融合表达，拟制备能够抵抗神经坏死病毒的粘膜疫苗；利用从NCBI GenBank库里获得的鱼类神经坏死病毒的外壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌的外膜蛋白ompN1的基因序列，将两者进行序列优化与全基因合成，分别构建原核表达载体:MCP-ompN1 pET28a和MCP pET28a和ompN1 pET28a，并在大肠杆菌内分别诱导表达融合蛋白MCP-ompN1，MCP，ompN1后，再利用包涵体纯化及透析复性获得MCP-ompN1，MCP，ompN1蛋白。SDS-PAGE结果显示，原核表达纯化得到了较纯的MCP-ompN1 融合蛋白，Western Blotting结果表明，纯化得到的MCP-ompN1 融合蛋白不仅具有MCP抗原性，还具有ompN1抗原性。本实验通过原核表达纯化得到了鱼类神经坏死病毒衣壳蛋白MCP和鮰爱德华氏菌外膜蛋白ompN1的融合蛋白MCP-ompN1，为进一步验证融合蛋白MCP-ompN1能否作为抵抗神经坏死病毒的粘膜疫苗奠定了基础。     

猪细小病毒SY-99株非结构蛋白NSl基因的克隆与原核表达

根据猪细小病毒 (porcineparvovirus ,PPV)NADL 2株非结构蛋白基因NS1序列设计引物 ,扩增出了PPVSY 99株的NS1基因 ,将其克隆到原核表达载体pET2 8a中 ,得到重组质粒SYNS1/pET2 8a。将SYNS1/pET2 8a转化到大肠杆菌BL2 1(DE3)中 ,经IPTG诱导 ,使PPVNS1基因获得了表达 ,运用ELISA和Westernblotting证实了表达产物的特异性。经表达产物细胞定位分析 ,表达的NS1蛋白是以包涵体的形式存在于大肠杆菌中。通过改变诱导时间或诱导剂IPTG的浓度 ,确定了表达NS1蛋白的最佳诱导条件 :IPTG终浓度为 0 .6mmol·L-1,诱导时间为 3h ,在大肠杆菌中最高表达含量为 17.8%。亲和层析后 ,得到了纯化的NS1蛋白 ,在Westernblotting检测中 ,纯化蛋白大大降低了反应背景。表达的NS1蛋白可作为免疫诊断试剂来检测PPV的发生 ,而且还可用于鉴别灭活疫苗免疫猪和自然感染猪     

水稻SDG711蛋白C末端原核表达及多克隆抗体制备

[目的]对水稻SDG711蛋白C末端进行原核表达,并制备其多克隆抗体。[方法]选取水稻SDG711蛋白抗原决定簇较密集的C末端进行原核表达,通过构建原核表达载体pET28a-711C,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达融合蛋白后进行纯化,再以纯化的融合蛋白为抗原免疫新西兰白兔,制备多克隆抗体,并对其进行Western-blot分析。[结果]试验制备的多克隆抗体能有效地检测抗原的表达。[结论]该研究为进一步深入研究SDG711蛋白的功能奠定了基础。     

丁香假单胞菌极毛蛋白hrpA基因的克隆与表达

将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.     

Molecular Cloning and Prokaryotic Expression of Non-Structural Protein NS1 Gene of Porcine Parvovirus

Porcine parvovirus (PPV) is one of the major agents causing swine reproductive failure. NS1protein is a non-structural protein of PPV and can be used as a reagent for differentiation of vaccinated ani-mals and infected ones. In present study, a recombinant plasmid pET28a/NS1 was constructed by cloning thecoding sequence for NS1 of PPV into pET28a, a bacterial expression vector. The NS1 protein was expressed inE. coli BL21 (DE3) after induced by IPTG and the recombinant fusion protein was purified with affinity chro-matography. Expression amount of NS1 protein was improved by optimizing the inducing parameters. The re-combinant NS1 protein is reactive to PPV positive sera in Western blot and ELISA test and therefore can beapplicable in differential diagnosis of PPV infections.     

固始鸡白细胞介素2基因的克隆、表达及其表达蛋白活性的检测

参照GenBank上已发表的鸡白细胞介素2序列设计引物,运用RT-PCR技术,从经ConA诱导的 20～35日龄固始鸡脾细胞总RNA中扩增出目的片段,IL-2基因,将其插入到pGEM-T载体上,构建了克隆质粒 pGEM-T-chIL-2。测序结果表明,本试验克隆的固始鸡白细胞介素2基因与GenBank上已发表的序列相比,存在2 个核苷酸变异。重新设计表达引物,以克隆质粒pGEM-T—chIL一2为模板PCR扩增表达片段,对表达片段进行 Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切,连接到作同样双酶切的pET28a表达载体上,鉴定后转化大肠杆菌BL21并进行IPTG 诱导表达,然后对表达产物进行SDS-PAGE电泳鉴定,结果表明,表达蛋白主要以包涵体的形式存在,表达蛋白分子质量约为18 ku;目的蛋白表达量占总量的18％。体外活性检测表明,重组蛋白具有促进淋巴细胞增殖的活性。     

新加坡石斑鱼虹彩病毒ORF39L基因克隆、表达及抗体的制备

为研究新加坡石斑鱼虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus,SGIV)核心基因ORF39L在病毒侵染过程中的作用,制备了SGIV ORF39L表达蛋白的抗体;通过生物信息学软件预测SGIV ORF39L的抗原表位基因,并以所选抗原表位基因片段39Ag1和39Ag2构建原核表达质粒pET32a-39Ag1和pET32a-39Ag2;将质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达融合蛋白pET32a-VP39Ag1和pET32a-VP39Ag2;用所得融合蛋白分别免疫小鼠,获得了高效特异抗体39Ab1和39Ab2;利用制备的抗体进行间接免疫荧光试验,结果显示,VP39参与了SGIV的装配。本研究结果为进一步研究ORF39L基因在SGIV感染过程中的作用机制提供了数据资料。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。