牛乳头瘤病毒基因1型广西GX01流行株全基因组克隆及序列分析

为了解牛乳头瘤病毒1型(bovine papillomavirus genotype 1,BPV-1)广西GX01株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,同时了解该毒株引起宿主产生的病理组织学变化情况,本研究选取广西贺州市患病牛皮肤肿瘤样物制作石蜡切片后镜检观察,提取病料DNA,以乳头瘤病毒L1基因的简并引物FAP59/FAP64进行PCR扩增以确定此病毒的基因型,根据GenBank中BPV参考株设计嵌套引物,对GX01株进行全基因组扩增、克隆测序及序列分析。病理组织学检查结果显示,可在病变部位发现表皮细胞增生、肿胀,角质过度及挖空细胞等乳头瘤病毒感染的特征性病变。序列分析结果表明,GX01株为BPV-1,其全基因组长为7 945bp,包含E1、E2、E4、E5、E6、E7、L1、L2 8个开放阅读框,符合BPV-1型基因组的结构特征;GX01与BPV-1参考株全基因组核苷酸序列同源性为98.6%~99.6%,与BPV-2型参考株(M20219.1)、BPV-13型参考株(JQ798171.1)同源性分别为86.9%和87.2%。GX01株为广西地区首次经检测确认并测定全基因组序列的牛乳头瘤病毒。本研究为广西地区乃至全国的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律、遗传变异、疫源追溯及科学防控提供了基础数据。     

牛乳头瘤病毒基因1型新疆南疆SY-12株全基因序列分析

为了掌握牛乳头瘤病毒基因1型(BPV-1)全长基因序列特征,提取已鉴定为牛乳头状瘤病毒基因1型病料的病毒基因组DNA,参照GenBank中参考序列设计扩增引物、测序引物,扩增各片段,纯化回收后送样测序,对得到序列进行全长序列分析。结果显示,新疆南疆SY-12株为BPV-1基因型,其全基因组长度为7 946 bp,具有BPV-1基因型的结构特征,与GenBank中的BPV-1基因型参考株核苷酸同源性高达99.4%。与BPV-2、BPV-13基因型参考株的进化关系最近,同为Delta属。表明新疆南疆BPV-1基因型SY-12株为Delta属牛乳头瘤病毒。     

新疆南疆牛乳头状瘤病毒鉴定与基因分型

为探究新疆南疆某奶牛场疑似感染牛乳头状瘤病及病毒基因型,本试验采取牛皮肤病变肿瘤样组织,进行组织病理学检查,并提取病料DNA,以乳头状瘤病毒(bovine papillomavirus,BPV)L1基因简并引物和通用引物(FAP59/FAP64和MY11/MY09)进行PCR扩增、测序、序列分析及遗传进化树构建。测序结果表明:新疆南疆Aks-01株与Gen Bank收录的BPV-2基因型参考株核苷酸序列比较,核苷酸同源性可达95%,为BPV-2基因型;与BPV-1、BPV-13基因型参考株遗传进化关系最近,同属Delta属。结合临床症状、组织病理学检查,确定该奶牛场牛乳头瘤由BPV-2基因型感染引起。     

牛乳头瘤病毒基因1型贵州GZLZ流行株全基因组序列测定及分析

为了解牛乳头瘤病毒(BPV)GZLZ流行株全基因组序列、结构特征及遗传变异情况,本研究首先提取贵州六枝患病牛皮肤肿瘤样品DNA,以BPV L1基因的简并引物对其进行PCR扩增,测序并构建BPVL1基因进化树确定其为BPV1基因型。根据GenBank中BPV1参考株设计7对特异性引物,经扩增、测序、拼接后获得BPV流行株全基因组序列。序列分析显示,贵州六枝GZLZ流行株基因组全长为7 946 bp,具有BPV1基因型的结构特征。本研究为贵州地区的牛乳头状瘤的病原鉴定、流行规律以及科学的防控提供依据。     

新疆某马场马乳头瘤病毒1型全基因组测定及分析

为探明引起新疆昌吉某马场呼吸困难纯血种公马鼻腔内乳头瘤样组织的病原,采集马鼻腔内乳头瘤样组织样品,采用高通量测序检测样品携带病毒多样性。结果显示,在乳头瘤样组织中检测到马乳头瘤病毒1型,命名为G2株。采用PCR方法扩增该病毒的全基因组序列,结果显示,EcPV-1 G2株与EcPV-1、EcPV-2-9参考株E6、E7、E1、E2、E4、L2和L1基因的核苷酸序列分别为99.0%～99.8%和30%～60%,氨基酸序列同源性分别为97.7%～99.2%和12.1%～56.7%。EcPV-1 G2株和EcPV-1参考株L1基因核苷酸同源性为98.8%～99.1%,表明该毒株为EcPV-1新型变异株。分离获得EcPV-1株并对其全基因组序列进行分析,可为新疆地区EcPV-1流行病学研究提供参考依据。     

猪乳头瘤病毒基因1型全基因组的克隆及序列分析

猪乳头瘤(SsP)是由猪乳头瘤病毒(SsPV)引起的一种猪传染性肿瘤。为了解SsPV中国流行株基因组信息,本研究对采集自广西的56份猪皮肤组织样品进行PCR检测,对检测为阳性的样品进行SsPV全基因组的克隆及序列分析。结果显示,56份广西猪皮肤组织样品中共检测出1份阳性样品,属于SsPV1,克隆序列拼接获得1株SsPV1全基因组序列,命名为SsPV1/GX12(MT078972)。SsPV1/GX12基因组全长为7 260 bp,编码7个主要开放阅读框。序列分析显示,SsPV1/GX12与参考株SsPV1a(EF395818)、SsPV1b(EF395819)、SsPV2(KY817993)核苷酸同源性分别为99.9%、99.2%、66.1%,与其他哺乳动物乳头瘤病毒核苷酸同源性为62.9%～69.5%。进化分析表明GX12属于SsPV1型。本研究首次获得中国SsPV分离株的全基因组信息,为开展SsP病原生物学、流行病学以及防控技术研究提供科学依据。     

广西牛病毒性腹泻病毒GX4分离株全基因测序及序列分析

牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)属于瘟病毒属,是养牛业中常见的病原体。通过MDBK细胞首次从广西分离获得1株牛源牛病毒性腹泻病毒,命名为GX4。设计引物对其全基因组进行扩增,获得其全基因序列,测序结果表明,GX4全基因组为12 218bp,编码3 898个氨基酸,GenBank登录号JN704144.1。对全基因序列进行分析,根据其5′-UTR,确定GX4属于BVDV-1b基因亚型;与BVDV其他参考毒株的比对发现,GX4与巴西分离株IBSP4ncp同源性最高,核苷酸同源性为94.4%,推导氨基酸同源性为96.2%,并且P125基因无外源序列插入,属于非细胞病变型。分子流行病学的结果,揭示了目前流行株的差异性,为该病的防控措施的制定提供参考。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1003株全基因序列测定与分析

为了解广西省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的遗传变异情况,采用RT-PCR对PRRSV广西地方分离株GX1003株全基因组进行分段扩增、测序与分析。结果表明,不包括Poly(A)尾,GX1003株基因组全长为15 320nt。同源性分析表明,GX1003株与比对的国内外PRRSV美洲型毒株全基因核苷酸及其推导氨基酸序列的同源性分别为85.0%～99.4%和82.1%～99.1%,与欧洲型代表株LV株的同源性分别为60.6%和51.3%。序列分析表明,GX1003株的NSP2编码区存在第481位aa和第533～561aa发生30个氨基酸的不连续缺失,具有高致病性PRRSV(HP-PRRSV)的遗传特征;同时,在不同编码区出现与HP-PRRSV代表株JXA1株不同的遗传变异现象。遗传进化分析表明,比对的所有美洲型毒株可以分为4个亚群,GX1003株分布在以JXA1株为代表的亚群4中。表明PRRSV广西地方分离株GX1003株属于HP-PRRSV,但其基因组在不同区域发生了新的遗传变异。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GX1001株和GX1002株全基因组分子特征分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异情况及分子遗传特征,采用RT-PCR分段扩增2010年PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株基因片段,经克隆、测序、拼接,获得2个分离株的全基因序列。结果显示,不包括Poly(A)尾,GX1001株、GX1002株基因组全长分别为15329和15318 bp。同源性分析结果表明,2个分离株间全基因组核苷酸序列同源性为99.3%,与国内外北美洲型代表毒株间的全基因组核苷酸序列同源性为84.9%~99.5%,与欧洲型代表毒株间的同源性为61.5%~61.9%。序列分析结果表明,2个分离株的NSP2编码区均存在第481和533-561位,共30个氨基酸的不连续缺失,具有PRRSV高致病性变异毒株(HP-PRRSV)的遗传特征,但分别在不同区域出现新的突变、缺失及插入等变异现象。遗传进化分析结果表明,所有美洲型毒株可分为4个亚群,GX1001株和GX1002株均属于以高致病性JXA1株为代表的第4亚群。上述结果表明,本研究获得的PRRSV广西地方分离株GX1001株和GX1002株均属于HP-PRRSV,但其基因组在不同区域发生了新的遗传变异现象。     

广西一株流行猪瘟毒株全基因序列的克隆和序列分析

本实验参照已发表的猪瘟病毒(CSFV)石门株、HCLV株、Paderborn株、GXWZ02株等的基因组序列设计合成了11对引物,通过RT-PCR方法从广西一株流行猪瘟病料中直接扩增得到了11个片段,将所得片段克隆至PGEM-Teasy载体上,经过测序、拼接,最终得到广西猪瘟GX54基因组全序列。序列分析表明,GX54基因组全长12296个碱基。与国内外已发表的10株猪瘟病毒系列进行同源性分析,结果表明,与各株核苷酸同源性分别为85.1%、85.0%、85.1%、84.7%、84.8%、94.4%、84.3%、94.3%、84.8%、84.5%。系统发育树分析发现,所比较的11个毒株可以分为2群,1群包括GX54,GXWZ02和Paderborn株,其余毒株属于2群,其中GX54株与GXWZ02株关系最近。     

Identification of unreported putative new bovine papillomavirus types in Brazilian cattle herds

The amplification by degenerate primers FAP59/FAP64 and sequencing allowed the detection of 15 putative new BPV types in cutaneous warts as well as in healthy skin. Four of these isolates were recently recognized as new BPV types (BPV-7, -8, -9, and -10) after determination of their complete genome sequences. In Brazil, investigations involving the definition of BPV types present in skin warts are still rare. The aim of the current study was to identify the BPV types associated with cutaneous papillomatosis observed in Brazilian cattle herds. Twenty-two cutaneous papilloma specimens were submitted to PCR assay employing the FAP primer pair. All PCR products with approximately 480 bp were submitted to direct sequencing. Cloning was performed for the amplicons which prior analysis revealed as putative new BPV types. From 16 cutaneous lesions, BPV-1, -2, and -6 were identified in two, six, and eight papilloma specimens, respectively. In addition, four putative new BPV types were identified in other six skin warts, and then designated as BPV/BR-UEL2 to -5. The detection of the BPV-1, -2, and -6 types in skin wart specimens supports the existence of these BPV types throughout the Brazilian cattle herd. In addition, the identification of four putative new BPV types is the first report of the presence of different BPV types in the American continent.     

Complete genome and phylogenetic analysis of bovine papillomavirus type 15 in Southern Xinjiang dairy cow

BackgroundBovine papilloma is a neoplastic disease caused by bovine papillomaviruses (BPVs), which were recently divided into 5 genera and at least 24 genotypes.ObjectivesThe complete genome sequence of BPV type 15 (BPV Aks-02), a novel putative BPV type from skin samples from infected cows in Southern Xinjiang China, was determined by collecting warty lesions, followed by DNA extraction and amplicon sequencing.MethodsDNA was analyzed initially by polymerase chain reaction (PCR) using the degenerate primers FAP59 and FAP64. The complete genome sequences of the BPV Aks-02 were amplified by PCR using the amplification primers and sequencing primers. Sequence analysis and phylogenetic analysis were performed using bio-informatic software.ResultsThe nucleotide sequence of the L1 open reading frame (ORF) of BPV Aks-02 was 75% identity to the L1 ORF of BPV-9 reference strain from GenBank. The complete genome consisted of 7,189 base pairs (G + C content of 42.50%) that encoded 5 early (E8, E7, E1, E2, and E4) and 2 late (L1 and L2) genes. The E7 protein contained a consensus CX₂CX₂₉CX₂C zinc-binding domain and a LxCxE motif. Among the different members of this group, the percentages of the complete genome and ORFs (including 5 early and 2 late ORFs) sequence identity of BPV Aks-02 were closer to the genus Xipapillomavirus 1 of the Xipapillomavirus genus. Phylogenetic analysis and sequence similarities based on the L1 ORF of BPV Aks-02 revealed the same cluster.ConclusionsThe results suggest that BPV type (BPV Aks-02) clustered with members of the Xipapillomavirus genus as BPV 15 and were closely related to Xipapillomavirus 1.     

猪源副黏病毒HX01株分离鉴定、全基因测序与遗传变异分析

从陕西省户县某猪场患流感样症状病死仔猪肺脏分离得到1株副黏病毒,命名为猪源副黏病毒（PPMV）HX01株,对分离毒株鉴定后进行部分生物学特性研究和全基因测序分析。参考PPMV JL-1株基因组序列设计10对引物,对PPMV HX01株分段扩增并测序,将测序成功的各序列依次拼接得到全基因序列并进行序列比对。该病毒MDT为91.2h,ICPI和IVPI为0,EID50为10-10.25/mL,表明该毒株属于新城疫弱毒株。序列分析结果表明,PPMV HX01株（全基因序列GenBank登录号：JF795531）与NDV参考毒株全基因核苷酸同源性83.3%～99.8%,该病毒与基因Ⅱ型我国传统弱毒疫苗株La Sota全基因水平和各个基因编码开放阅读框的同源性均在99.5%以上,而与基因Ⅸ型国家标准强毒株F48E9和目前流行的基因Ⅶ型毒株亲缘关系较远。     

猪流行性腹泻病毒CH/GX/2015/750A株的分离鉴定及全基因组序列分析

本研究旨在获得可在细胞培养中稳定、有效生长增殖的猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）分离毒株,并对其全基因组序列进行测定分析。应用Vero细胞从广西腹泻仔猪肠道内容物中进行病毒分离,通过细胞病变和RT-PCR对细胞培养物进行鉴定,应用下一代测序技术对分离毒株全基因组序列进行测定。结果显示,成功分离到1株PEDV,命名为CH/GX/2015/750A。该毒株可稳定有效地在Vero细胞生长增殖,并引起典型的细胞病变;已在Vero细胞连续传代25代,病毒滴度随着传代次数的增加逐渐提高并稳定在10^7.50TCID₅₀/mL。该毒株全基因组序列长28 038 bp;与22个参考毒株的全基因序列比对显示,核苷酸同源性为96.8%~99.8%,其中与YC2014株同源性最高,为99.8%。全基因组和S基因系统进化分析显示,PEDV CH/GX/2015/750A分离毒株属于Ⅱa亚群,与YC2014、PEDV-WS等变异毒株亲缘关系密切。结果表明,本研究分离获得的CH/GX/2015/750A毒株是PEDV地方流行变异毒株。     

猪链球菌2型广西GX01株Cps2J基因克隆与序列分析

将分离到的广西猪链球菌2型,用针对猪链球菌2型Cps2J序列的引物Cps1/Cps2进行扩增,得到与预期相符的675 bp的片段,将PCR产物回收连接转化后测序,得到了675 bp的核苷酸序列,经同源性分析表明,GX01株Cps2J序列与猪链球菌2型国内外的毒株核苷酸同源性在98.7%~100%之间,具有高度的同源性;与猪链球菌1型的同源性只有66.7%。     

广西猪瘟病毒E0和E2基因的克隆及序列分析

通过分析目前广西猪瘟病毒(CSFV)的E0和E2基因特征,为了解广西地区CSFV的分子流行病学、遗传变异及综合防控提供科学依据。试验采用RT-PCR方法,对阳性猪瘟样品进行CSFV的E0及E2基因的扩增,经克隆、测序后,利用DNAStar软件对序列进行比对分析,同时绘制系统遗传进化树。结果表明,从阳性猪瘟样品中成功扩增CSFV的E0及E2基因。序列比对分析发现,GX2毒株与参考毒株的E0基因核苷酸同源性在83.1%~94.1%,其推导氨基酸同源性在85.9%~99.6%;与参考毒株的E2基因核苷酸同源性为81.7%~93.7%,其推导氨基酸同源性为89.0%~97.0%;E0与E2基因均属于基因Ⅱ群。氨基酸变异位点分析表明,E0蛋白的RNase活性区域氨基酸基序位点没有发生变异;E2蛋白中15个位点上的半胱氨酸均未发生变异,但单抗识别位点S734R发生变异。遗传进化分析显示测定的GX2毒株与近年来广西CSFV流行毒株的变异趋势相似,与中国传统疫苗株HCLV、经典强毒株Shimen的同源性较低,亲缘关系较远,与广西近年来的流行毒株GXWZ02株的同源性较高,亲缘关系较近。     

Cloning and Sequence Analysis of P97 Gene R1 Region of Mycoplasma hyopneumoniae in Guangxi Luchuan Pig

Through in-depth understanding of sequence characteristics, structure and genetic variation of adhesion factor P97 gene R1 region of Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp) epidemic strains in Guangxi Luchuan pig, the assay was aimed to provide theoretical basis for mycoplasmal pneumonia of swine (MPS) integrated effective prevention and control measures of Guangxi local variety Luchuan pig, and lay a solid foundation for further study the characteristics of Mhp epidemic strains in Guangxi Luchuan pig.A pair of primers was designed to amplify P97 gene R1 region according to Mhp genome sequence, the MPS positive disease materials of Guangxi Luchuan pig from 2011 to 2014 as the object of study, after genomic DNA extraction and PCR amplification of P97 gene R1 region, the PCR products were sequenced.The base composition and deduced amino acid sequence of P97 gene R1 region of Mhp epidemic strains of Guangxi Luchuan pig were compared.The analysis of DNAStar showed that there were multiple base mutations in P97 gene R1 region of 15 strains of Guangxi Luchuan pig Mhp strains (GXLC-1, GXLC-2, GXLC-3, GXLC-4, GXLC-5, GXLC-6, GXLC-7, GXLC-8, GXLC-9, GXLC-10, GXLC-11, GXLC-12, GXLC-13, GXLC-14 and GXLC-15) and 3 strains of Guangxi other breeds of pigs Mhp strains (GX227, GX595 and GX674).The statistical repeat number of five amino acid (AAKPV/E) of P97 R1 region were 9 to 18, the average value was 12, TN repeats were 1 to 4.We found that Guangxi Luchuan pig Mhp strains mutation made its virulence and adhesion ability enhancement, and respiratory of Luchuan pig with the special structure of short and narrow, which could more easily lead to the occurrence of Guangxi Luchuan pig MPS.     

广西陆川猪猪肺炎支原体P97基因R1区克隆及序列分析

本试验通过深入了解广西陆川猪猪肺炎支原体(Mhp)地方流行毒株的黏附因子P97基因R1区的序列特征、基本结构及遗传变异等特点,为广西地方品种陆川猪猪支原体肺炎(MPS)有效的综合防控措施提供理论依据,并为进一步研究广西陆川猪Mhp地方流行毒株特性打下坚实的基础。参考Mhp基因组序列设计扩增P97基因R1区的1对引物,以 2011年-2014年广西陆川猪MPS阳性病料为研究对象,提取基因组DNA,PCR扩增P97基因R1区,对PCR产物进行测序,将广西陆川猪Mhp不同地方流行毒株的P97基因R1区序列的碱基组成和推导的氨基酸序列进行比对。DNAStar软件分析结果表明,所获得的15株广西陆川猪Mhp毒株(GXLC-1、GXLC-2、GXLC-3、GXLC-4、GXLC-5、GXLC-6、GXLC-7、GXLC-8、GXLC-9、GXLC-10、GXLC-11、GXLC-12、GXLC-13、GXLC-14、GXLC-15)和3株广西其他品种猪Mhp毒株(GX227、GX595、GX674)的P97基因R1区的多处碱基发生变异。通过推导氨基酸序列统计P97 R1区五氨基酸(AAKPV/E)重复数为9~18,平均值为12,TN重复数为1~4,结果发现广西陆川猪Mhp流行毒株变异使其毒力和黏附能力增强,再加上陆川猪呼吸道短小狭窄的特殊结构,更易导致广西陆川猪MPS的发生。     

3株鸡传染性贫血病毒的全基因组序列分析

通过对3株鸡传染性贫血病毒(CIAV)的全基因组序列比较分析,部分表明广西南宁鸡群CIAV毒株的遗传变异特征。将阳性CIAV的组织样品进行DNA抽提后,运用PCR方法分段扩增CIAV的全基因组,将获得的PCR产物进行基因克隆并进行阳性克隆菌鉴定后送测序。将所获得的基因序列进行拼接成CIAV基因组全长后,应用LaserGene7.1和MEGA4.1软件对CIAV全基因、Viral protein 3(VP3)、Viral protein 1(VP1)和Viral protein 2(VP2)基因序列进行核苷酸、氨基酸同源性分析和遗传进化分析;并对VP1、VP2和VP3蛋白上与毒力、蛋白磷酸酶活性和细胞凋亡相关的氨基酸位点进行分析。结果获得3株CIAV的全基因序列,分别命名为GX1801、GX1804和GX1810;CIAV全基因遗传进化分析表明GX1801、GX1804和GX1810均同属于Group A群,与国内强毒株GD-103和GD-104毒株的亲缘关系较近;基于VP1基因构建的遗传进化树与全基因构建的进化树最相似;GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白上与毒力相关位点的第75、89、125、141、144、394位氨基酸位点与日本强毒株C368株、国内强毒株GD-103和GD-104株在同一位点保持一致;GX1801、GX1804和GX1810 VP2蛋白上与磷酸酶活性相关的基序(I^94CNCGQFRKH^103)均未发生变异;GX1801、GX1804和GX1810 VP3蛋白与诱导细胞凋亡相关的重要区域(VP3蛋白N端结构域的第1~69位氨基酸)均高度保守。本研究对3株CIAV全基因组进行测定并进行基因分析,获得了其基因组特征,为进一步研究广西CIAV的分子流行和致病性提供参考。