芦花鸡IFITM3基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在对芦花鸡的干扰素诱导的跨膜蛋白-3(interferon-induced transmembrane protein 3,IFITM3)基因进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中鸡IFITM3基因序列(登录号:NM_001350061.1)设计特异性引物,利用RT-PCR技术对芦花鸡IFITM3基因进行克隆、测序和生物信息学分析。结果表明,芦花鸡IFITM3基因片段大小为414bp,与GenBank中发表的鸡IFITM3基因序列(登录号:NM_001350061.1)同源性为99.9%;编码137个氨基酸。IFITM3基因理论分子质量为14.95ku,理论等电点(pI)为6.89,不稳定系数为33.98,脂肪系数为103.14,平均疏水指数为0.300,存在3个明显的疏水区,无信号肽,存在2个跨膜区,分别位于第46-68、101-123位氨基酸处;二级结构预测显示,IFITN3蛋白主要以无规则卷曲为主,存在多个α-螺旋和β-折叠区域。本研究成功克隆了芦花鸡IFITM3基因,为进一步研究IFITM3蛋白功能及阐明其抗病毒分子机制奠定了理论基础。     

猪GRP78基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究

本研究旨在克隆猪葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）基因，并进行生物信息学分析，探讨其在猪不同组织中的表达情况。根据GenBank上公布的猪GRP78基因序列（登录号：XM_001927795.6）设计引物，PCR扩增及测序获得猪GRP78基因CDS序列，使用在线软件分析GRP78的理化性质、跨膜结构、信号肽、疏水性、保守结构域、二级结构和三级结构，并进行同源性比对及系统进化树构建，利用实时荧光定量PCR方法检测猪GRP78基因在各组织中的表达情况。结果显示，猪GRP78基因CDS区长1 965 bp，可编码654个氨基酸。生物信息学分析表明，GRP78理论分子质量为72.3 ku，等电点（pI）为5.06，半衰期为30 h，其水溶液在280 nm处的消光系数为30 495，肽链N端为蛋氨酸（Met），不稳定系数为32.39，属于稳定蛋白。脂肪系数为85.40，总平均疏水指数为-0.496，无跨膜结构，存在信号肽序列，说明该蛋白属于分泌型蛋白；GRP78蛋白只包含1个超家族保守结构域：HSP70结构域。蛋白二级结构分析显示，GRP78蛋白中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别为40.06%、20.49%、8.10%和31.35%。同源性比对结果显示，猪GRP78基因与人（登录号：NM_005347.4）、小鼠（登录号：NM_001163434.1）、大鼠（登录号：NM_013083.2）、山羊（登录号：XM_005687138.3）、牛（登录号：NM_001075148.1）核苷酸序列的同源性分别为93%、91%、90%、95%、95%，氨基酸序列的同源性分别为99%、98%、98%、99%、99%，各个物种之间GRP78基因保守性较高。实时荧光定量PCR结果显示，GRP78基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胃、卵巢、输卵管、乳腺、小脑、大脑、垂体等组织中均有表达，在心脏、脾脏、肺脏中相对高表达。本研究结果为今后深入研究GRP78基因的生物学功能提供了基础材料。     

塔里木马鹿干旱环境适应相关基因的筛选、克隆及生物信息学分析

为了探讨塔里木马鹿（Cervus elaphus yarkandensis）干旱环境适应相关基因的结构特征和相关功能,从前期的塔里木马鹿全基因组重测序结果中,筛选获得塔里木马鹿过氧化物氧化还原酶3（thioredoxin-dependent peroxide reductase,PRDX3）基因的序列,对该基因在塔里木马鹿不同组织中的表达情况进行分析,同时对塔里木马鹿PRDX3基因编码区（CDS）序列进行克隆测序,运用相关软件进行同源性比对、构建系统进化树及生物信息学分析。结果显示,塔里木马鹿PRDX3基因在肾脏组织中的基因表达水平极显著高于肺脏和肝脏组织（P<0.01）;塔里木马鹿PRDX3基因CDS序列长660 bp。同源性比对和系统进化树分析结果表明,塔里木马鹿与白尾鹿（GenBank登录号：XM_020875097.1）同源性最高,且遗传距离最近;与褐家鼠（GenBank登录号：NM_022540.1）同源性最低,且遗传距离最远。塔里木马鹿PRDX3蛋白分子质量为24.42 ku,由220个氨基酸组成,不稳定系数为25.36,理论等电点（pI）为5.82,脂溶系数为85.50,总平均亲水性为-0.05,存在O-糖基化位点,具有丰富的磷酸化位点,但是不存在N-糖基化位点、跨膜区及信号肽,最可能位于线粒体中,二级结构和三级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,包含PRX_Typ2cys超家族保守结构域,与多种蛋白存在相对较强的相互作用。本研究为后续的塔里木马鹿功能基因的研究奠定基础。     

猪GRP78基因克隆、生物信息学分析及组织表达谱研究

本研究旨在克隆猪葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78,GRP78)基因,并进行生物信息学分析,探讨其在猪不同组织中的表达情况。根据GenBank上公布的猪GRP78基因序列(登录号:XM_001927795.6)设计引物,PCR扩增及测序获得猪GRP78基因CDS序列,使用在线软件分析GRP78的理化性质、跨膜结构、信号肽、疏水性、保守结构域、二级结构和三级结构,并进行同源性比对及系统进化树构建,利用实时荧光定量PCR方法检测猪GRP78基因在各组织中的表达情况。结果显示,猪GRP78基因CDS区长1 965bp,可编码654个氨基酸。生物信息学分析表明,GRP78理论分子质量为72.3ku,等电点(pI)为5.06,半衰期为30h,其水溶液在280nm处的消光系数为30 495,肽链N端为蛋氨酸(Met),不稳定系数为32.39,属于稳定蛋白。脂肪系数为85.40,总平均疏水指数为-0.496,无跨膜结构,存在信号肽序列,说明该蛋白属于分泌型蛋白;GRP78蛋白只包含1个超家族保守结构域:HSP70结构域。蛋白二级结构分析显示,GRP78蛋白中α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别为40.06%、20.49%、8.10%和31.35%。同源性比对结果显示,猪GRP78基因与人(登录号:NM_005347.4)、小鼠(登录号:NM_001163434.1)、大鼠(登录号:NM_013083.2)、山羊(登录号:XM_005687138.3)、牛(登录号:NM_001075148.1)核苷酸序列的同源性分别为93%、91%、90%、95%、95%,氨基酸序列的同源性分别为99%、98%、98%、99%、99%,各个物种之间GRP78基因保守性较高。实时荧光定量PCR结果显示,GRP78基因在心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠、胃、卵巢、输卵管、乳腺、小脑、大脑、垂体等组织中均有表达,在心脏、脾脏、肺脏中相对高表达。本研究结果为今后深入研究GRP78基因的生物学功能提供了基础材料。     

四川草科IL-15 cDNA的克隆与序列分析

根据GenBank上登录的鸡白介素15（IL-15）基因序列,设计合成一对特异性引物,以ConA诱导的鸡脾淋巴细胞提取的总RNA为模板进行RT—PCR扩增,并克隆到pMD18-T载体测序。测序结果表明,四川草科鸡IL-15开放阅读框（ORF）由564个核苷酸组成,编码187个氨基酸,与GenBank中公布的鸡白介素15基因进行比较,核苷酸和氨基酸同源性为98．6％-99．5％。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白具有亲水性,有很强的抗原性,共有3个潜在的N-糖基化位点,可能存在3个蛋白激酶C磷酸化位点,存在2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。     

西农萨能羊两个泌乳阶段差异表达基因SAA3的克隆和序列分析

为了研究不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因，利用抑制性削减杂交技术构建西农萨能羊泌乳60d乳腺组织及泌乳28d乳腺组织中差异表达基因文库，用Real-Time PCR技术验证阳性克隆血清淀粉样蛋白A3（SAA3）基因，通过RT-PCR方法克隆西农萨能羊乳腺组织SAA3，并进行序列比对和功能预测。结果成功构建了西农萨能羊不同泌乳期乳腺组织中差异表达基因文库，筛选克隆了乳腺组织SAA3基因，GenBank登录号为：DQ839400，编码区长度为396bp，含有131个氨基酸。西农萨能羊乳腺组织中SAA3与牛（GenBank：NM_181016）、兔（GenBank：M64696．1）、人（GenBank：BC020795）、鼠（GenBank：NM_011315）核苷酸同源性分别为95％、84．3％、81.3％和81.9％，氨基酸同源性为93％、76％、72％、72％；在编码区261-287位较人、兔、鼠SAA编码区多27个碱基，连续大于5个氨基酸的保守区域有6个，较人SAA多3个潜在功能基序。     

牛卵形巴贝斯虫伴侣素CCT_η基因的克隆与生物信息学分析

对牛卵形巴贝斯虫延边株的伴侣素CCTη基因进行分子克隆,并利用生物信息学软件对CCTη基因进行了同源性、系统进化树、编码蛋白等电点、信号肽、跨膜区、糖基化位点及疏水性分析。结果显示,克隆的CCTη基因由1 008个核苷酸组成,其中编码335个氨基酸。与GenBank上发表的牛卵形巴贝斯虫CCTη基因序列(AB367928.1)同源性100%。CCTη基因编码蛋白等电点为7.32,不存在信号肽结构、跨膜区及糖基化位点。疏水性最大值3.38,最小值-3.79。本研究从CCTη基因方面近一步证实了该分离株的分子分类。     

羊源多杀性巴氏杆菌sodA基因的克隆、表达及其生物信息学分析

为了解羊源多杀性巴氏杆菌超氧化物歧化酶（SOD）的生物学功能,本试验对该菌sodA基因进行克隆及原核表达,并对克隆的sodA基因进行遗传进化树分析,对其表达的SOD蛋白进行生物信息学分析。参照GenBank中多杀性巴氏杆菌HN06株基因组中sodA基因序列信息设计引物进行PCR扩增,将产物与pET-28a（+）载体相连,构建pET-28a（+）-sodA重组质粒,将该质粒转化E.coli DH5α感受态细胞进行克隆,再转化E.coli BL21（DE3）感受态细胞进行表达,经IPTG诱导后对表达蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定分析。结果显示,本试验成功扩增出大小为645 bp的目的片段,并表达出大小约28 ku的目的蛋白。遗传进化树分析表明,该基因与HN07（GenBank登录号：CP007040.1）和Pm70（GenBank登录号：AE004439.1）株亲缘关系较近,重组蛋白生物信息学分析显示,该融合蛋白为稳定的酸性亲水可溶性蛋白,分子式为C₁₀₈₅H₁₆₅₁N₂₉₃O₃₀₉S₉,分子质量为24 032.36 u,理论等电点为6.19,消光系数为45 170,不稳定系数为26.87（<40）,在哺乳动物网织红细胞的半衰期预计为30 h,疏水指数为82.15,总平均疏水性（GRAVY）为-0.282,二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。以上研究结果为后续深入研究多杀性巴氏杆菌在羊体内的存活机制及研发预防巴氏杆菌病的疫苗提供了参考。     

羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因的克隆及生物信息学分析

试验旨在克隆羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因，并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中多杀性巴氏杆菌HN07株ompW基因序列（登录号：CP007040.1），使用DNAMAN 5.0软件设计1对引物，选取高保真酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase进行PCR反应获取目的基因片段，并对ompW基因的核苷酸序列及预测的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明，PCR扩增产物约为615 bp，编码204个氨基酸。核苷酸同源性比对分析显示，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源、牛源、禽源多杀性巴氏杆菌同源性较高，而与兔源同源性较低。系统进化树结果发现，羊源多杀性巴氏杆菌ompW基因与猪源多杀性巴氏杆菌ompW基因亲缘关系最近。经生物信息学分析发现，ompW蛋白分子式为C₁₀₀₇H₁₅₆₇N₂₅₇O₂₈₃S₃，分子质量为21.90 ku，理论等电点（pI）为9.16，属碱性蛋白质，疏水指数为96.57，总平均疏水性（GRAVY）为0.173（> 0），属于疏水类蛋白；前21位氨基酸为信号肽，第5－27位氨基酸区域存在1个跨膜区，存在N-糖基化位点及磷酸化位点，不存在O-糖基化位点，具有多个B细胞、CTL细胞及Th细胞抗原表位；二级结构的α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲分别占17.65%、35.29%、3.92%和43.14%；三级结构是呈β-桶状的单聚体，隶属于外膜蛋白家族成员之一。本研究结果为进一步阐明羊源多杀性巴氏杆菌侵染宿主过程中自身的抗宿主免疫胁迫机制及疫苗的开发与研制提供了理论依据。     

水牛溶血磷脂酸受体3基因的克隆及生物信息学分析

本试验旨在进行水牛溶血磷脂酸受体3（lysophosphatidic acid receptor 3，LPAR3）基因的克隆及生物信息学分析。以水牛卵巢组织DNA为模板，参考GenBank中公布的水牛LPAR3基因（登录号：XM_006047539.1）序列设计引物，利用PCR扩增水牛LPAR3基因序列，并对其进行生物信息学分析。结果显示，水牛LPAR3基因全序列为1 552 bp，包含1个1 062 bp的CDS序列，编码353个氨基酸。同源性对比结果表明，水牛LPAR3基因编码的氨基酸序列与美洲野牛、黄牛、绵羊、野猪、马、果蝠、白眉猴同源性分别为99.4%、98.9%、98.0%、88.6%、90.0%、90.3%和91.2%，表明LPAR3基因在不同物种间具有较高的保守性。LPAR3蛋白分子式为C₁₈₅₃H₂₈₇₈N₄₇₆O₄₈₆S₃₁，分子质量为40.59 ku，理论等电点（pI）为9.52，不稳定系数为47.05，平均亲水性为0.324，属于碱性不稳定疏水蛋白质；该蛋白质存在7个跨膜结构且无信号肽，属于非分泌蛋白；二级结构分析表明LPAR3以α-螺旋、无规则卷曲和延伸链为主，其中α-螺旋占48.16%，无规则卷曲占41.36%，延伸链占10.48%，属于全α类蛋白质，与三级结构预测结果一致；亚细胞定位分析发现，LPAR3蛋白分布在等离子体膜（56.5%）、内质网（26.1%）、空泡（8.7%）、高尔基体（4.3%）和细胞核（4.3%）中，推测可能在运输和结合及嘌呤和嘧啶等方面发挥转运蛋白和信号转导等作用。本试验结果可为今后深入探讨LPAR3基因功能奠定基础。     

水牛甲状旁腺素1受体基因CDS区克隆与生物信息学分析

试验旨在对水牛甲状旁腺素1受体（parathyroid hormone 1 receptor,PTH1R）基因CDS区进行克隆,并对所获序列进行生物信息学分析,以期丰富水牛PTH1R基因研究的基础数据。提取水牛基因组DNA,以牛PTH1R基因为参考序列（GenBank登录号：NM_001075332.1）,应用Primer Premier 5.0软件设计引物序列,运用PCR扩增及测序获得水牛完整CDS区序列,使用DNAMAN、ProtParam、SOPMA、PSORT Ⅱ Prediction等在线分析软件分析PTH1R的一级结构、二级结构、三级结构与理化性质,并进行同源性分析及构建系统进化树。结果显示,试验成功克隆了水牛PTH1R基因完整编码序列,该序列长为2 283 bp,CDS区长1 770 bp,序列已提交GenBank,登录号：MF380401,可编码589个氨基酸。PTH1R基因CDS区核苷酸序列与黄牛、猪、马、山羊、绵羊和骆驼同源性比对结果显示,其同源性分别为99.4%、93.2%、93.5%、95.3%、98.1%和93.9%,物种之间同源性较高,进化树分析结果与其亲缘关系远近一致,表明水牛PTH1R基因编码区在进化过程中比较保守。蛋白理化性质分析显示,水牛PTH1R蛋白分子式为C₂₉₉₆H₄₆₁₆N₇₉₂O₈₂₃S₃₀,分子质量为65 860.22 u,半衰期为30 h,理论等电点（pI）为8.37,水溶液在280 nm处的消光系数为117 770,肽链N端为M（Met）,不稳定系数为43.36,属于碱性不稳定蛋白。脂肪系数为88.61,总平均亲水性为0.007,该蛋白属于不可溶性蛋白。二级结构分析显示,水牛PTH1R基因蛋白中包含有218个α-螺旋、114个延伸链、44个β-转角、213个无规则卷曲,与三级结构预测结果相一致。综上所述,PTH1R基因编码区在长期生物进化过程中具有较强的保守性,PTH1R基因的成功克隆及分析为进一步揭示其遗传特性提供了理论依据。     

三黄鸡ST3Gal6基因的半定量RT-PCR及生物信息学分析

本研究旨在对三黄鸡ST3Gal6基因进行组织表达谱和生物信息学分析。参考三黄鸡ST3Gal6基因序列设计引物,采用PCR技术克隆三黄鸡ST3Gal6基因序列,并利用半定量RT-PCR进行组织表达谱分析;同时对其进行生物信息学分析。结果表明,克隆的三黄鸡ST3Gal6基因全长1169 bp,含有1059 bp的完整CDS编码区,编码352个氨基酸。其CDS编码区的核苷酸序列与人、黑猩猩、牛、大鼠、蟾ST3Gal6基因对应序列的同源性分别为62%、62%、61.9%、59%、54.4%。组织表达谱分析表明,ST3Gal6基因在各组织均不同程度地表达,其中在大脑表达量很高,肺脏中最低。生物信息学预测ST3Gal6蛋白结构发现,三黄鸡的ST3Gal6蛋白存在2个跨膜螺旋结构域,同时预测ST3Gal6存在22个磷酸化位点和1个特异性蛋白激酶磷酸化位点。     

陆川猪脂酰辅酶A氧化酶1基因克隆及序列分析

本研究旨在对陆川猪脂酰辅酶A氧化酶1（acyl-coenzyme A oxidase 1,ACOX1）基因进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中猪ACOX1基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术对陆川猪ACOX1基因进行克隆、测序和生物信息学分析。结果表明,陆川猪ACOX1基因CDS全长1 986 bp,编码661个氨基酸,陆川猪ACOX1基因与猪、牛、人、斑马鱼、鸡、猕猴、大鼠、小鼠、爪蟾序列同源性分别为99.5%、85.5%、87.1%、66.3%、75.6%、84.0%、82.3%、81.1%和69.1%。系统进化树分析结果表明,ACOX1基因在不同物种及进化的过程中具有高度保守性,蛋白质二级结构预测结果表明,陆川猪ACOX1蛋白没有信号肽,没有形成跨膜结构。本研究成功克隆了陆川猪ACOX1基因,为阐明其在陆川猪脂肪沉积及代谢方面的调控研究奠定了理论基础。     

陆川猪Occludin基因克隆及生物信息学分析

本试验旨在获得陆川猪Occludin基因的编码区（CDS）序列,并对其进行生物信息学分析。根据GenBank中公布的猪Occludin基因序列（登录号：NM_001163647.2）设计1对特异性引物,采集健康陆川猪的回肠组织提取总RNA并反转录成cDNA,以cDNA作为模板进行RT-PCR扩增并获得目的基因片段,将其插入pMD18-T载体,筛选阳性克隆菌测序正确后并利用生物信息学软件对所获序列进行分析。结果表明,试验成功克隆获得陆川猪Occludin基因CDS,长度为1 569 bp,共编码522个氨基酸。序列比对结果显示,陆川猪Occludin基因与参考序列的同源性为99.7%,存在3个差异位点,其中第16 bp处C→T为错义突变,引起第6位的亮氨酸变成苯丙氨酸;第1 059 bp处A→G和第1 218 bp处C→T均为同义突变,该错义突变位点可能是陆川猪肠道屏障功能与其他猪种不同的原因。同源性比对结果显示,陆川猪Occludin基因与小鼠、牛、人、果蝇、猕猴和犬的同源性分别为83.8%、89.5%、88.1%、84.1%、88.3%和86.6%。系统进化树分析发现,陆川猪与牛的遗传距离最近,与犬的遗传距离最远。Occludin蛋白分子质量为59.13 ku,氨基酸组成中丝氨酸含量较高（9.2%）,在肽链N端为Met,Occludin蛋白在水溶液中280 nm消光系数为96 415,不稳定指数为62.85,属于不稳定蛋白。疏水性分析结果表明,Occludin蛋白是亲水性蛋白。陆川猪Occludin蛋白存在5个跨膜螺旋区,不存在信号肽,包含2个超家族结构域：MARVEL超家族结构域和Occludin-ELL超家族结构域。二级结构预测结果显示,陆川猪Occludin蛋白中α-螺旋、延伸链及无规则卷曲分别占41.00%、5.36%和53.64%,三级结构与二级结构相一致。本试验成功克隆了陆川猪Occludin基因CDS并进行了生物信息学分析,为深入探讨Occludin基因对地方猪种肠道屏障功能的影响提供参考。     

Cloning and Sequence Analysis of ACOX1 Gene in Luchuan Pig

The objective of this study was to clone the acyl-coenzyme A oxidase 1 (ACOX1) gene of Luchuan pig and analyze its genetic structure with bioinformatics. A pair of special primer was designed according to predicted sequence of pig ACOX1 gene in GenBank. The ACOX1 gene was amplified by RT-PCR, the physicochemical property and secondary structure of ACOX1 gene were systemically analyzed by bioinformatics techniques. The results showed that ACOX1 gene fragment included an 1 986 bp whole length CDS (coding 661 bp amino acids). The sequence multi-aligned results showed that Luchuan pig shared 99.5%, 85.5%,87.1%,66.3%,75.6%,84.0%,82.3%,81.1% and 69.1% of similar nucleotide sequence with that of pig,human, zebrafish, chicken, rhesus monkeys, mice, rat and frog, respectively. The prediction of ACOX1 secondary structure showed that Luchuan pig ACOX1 had no signal peptide and transmembrane structure. This study suggested that the whole CDS sequence of ACOX1 gene was successfully cloned in Luchuan pig, and the cloning and analysis of ACOX1 gene provided an important foundation for further studying on the fatty deposition and lipornetabolism of ACOX1 gene in Luchuan pig.     

山羊PNPLA3基因克隆及序列分析

PNPLA3蛋白属于patatin样磷脂酶家族,能够参与脂肪积累和脂肪动员,且该蛋白与肝脏炎症、肝纤维化密切相关。本研究旨在克隆PNPLA3基因序列并进行生物信息学分析,以简州大耳羊为实验对象,屠宰后,采集皮下脂肪组织,Trizol法提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆山羊PNPLA3基因序列,对所获得的序列进行生物信息学分析。结果显示:克隆得到山羊PNPLA3基因序列1564 bq(GenBank登陆号:MN643056),其中CDS区1344bp,5'UTR234bp,3'UTR49bp,编码447个氨基酸残基;山羊PNPLA3氨基酸序列与绵羊(Ovis aries)、牛(Bos taurus)、大鼠(Rattus norvegicus)、小鼠(Mus musculus)和人(Homo sapiens)的氨基酸序列相似性分别达到83.89%、81.21%、56.38%、56.15%、58.42%;山羊PNPLA3蛋白与绵羊亲缘关系最近,而与原鸡(Gallus gallus)的亲缘关系较远;山羊PNPLA3蛋白为疏水性酸性蛋白,大部分由α螺旋和无规则卷曲构成,分别占比44.07%、39.6%,有18个丝氨酸、3个苏氨酸、3个酪氨酸磷酸化位点,无信号肽剪切位点,有2个跨膜结构域,具有1个PNPLA家族同源结构域,STRING数据库检索到PNLIP、PNPLA2、LIPC、PNLIPRP3等蛋白可能与PNPLA3蛋白存在相互作用关系。本实验成功克隆出山羊PNPLA3基因,为进一步阐明PNPLA3基因在调控山羊脂质代谢中的作用及分子机制提供基础资料。     

鸡EED基因的原核表达与生物信息学分析

本研究旨在获得鸡胚胎外胚层发育（embryonic ectoderm development，EED）原核表达蛋白，并利用生物信息学方法探索其潜在生物学功能。以提取的3日龄雏鸡脾脏总RNA为模板，利用RT-PCR技术扩增鸡EED基因，将其克隆至pET-32a （+）载体，构建重组表达载体pET-32a-EED，转化至大肠杆菌Rosetta感受态细胞中进行IPTG诱导表达；Western blotting检测经镍离子亲和层析法纯化的鸡EED蛋白，并利用在线软件对其进行生物信息学分析。结果显示，鸡EED基因序列全长1 341 bp，与参考序列（GenBank登录号：NM_001031376.1）相似性为99.85％；当诱导温度为28 ℃，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导剂诱导表达7 h时，可在重组菌裂解上清中纯化得到分子质量约70 ku的鸡EED融合蛋白。在线软件分析表明，鸡EED蛋白相对分子质量为50 377.92，理论等电点（pI）为6.54，为亲水蛋白，无跨膜结构域和信号肽序列，该蛋白序列与人多疏蛋白EED三级结构模板序列（6c23.1）相似，同样具有肿瘤靶点WD40结构域。结果表明，本研究成功获得大肠杆菌表达的鸡EED可溶性蛋白，且该蛋白具有重要的功能元件，可为深入探索鸡EED蛋白的生物学功能与调控机理提供材料。     

山羊GATA3基因克隆及其真核表达载体构建

本研究旨在克隆山羊GATA3(GATA binding protein 3)基因,构建其真核表达载体,并对该基因进行生物信息学分析。以山羊GATA3基因编码区为种子序列(GenBank登录号:XM_018056969.1),通过SnapGene 4.1.9软件设计引物序列,应用RT-PCR方法扩增山羊GATA3基因完整编码区序列,测序鉴定后基于其核苷酸序列和蛋白质序列进行生物信息学分析,并构建pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1慢病毒重组质粒。利用脂质体转染方法将慢病毒重组质粒pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1与病毒包膜质粒pCMV-VSVG、包装质粒pNRF共转染HEK-293T细胞,进行慢病毒包装后收集病毒上清液,成功感染山羊耳尖成纤维细胞。结果显示,山羊GATA3基因编码区序列全长1335 bp,编码444个氨基酸,分子质量为47.94 ku,分子式为C2093H3234N626O625S24,等电点为9.47,其中丝氨酸含量最高(13.3%),色氨酸含量最低(1.1%)。山羊GATA3基因核苷酸序列与牛、猪、驴、马、小鼠及人的相似性分别为97.7%、94.2%、92.2%、92.4%、88.0%和90.1%,不同物种间相似性较高,进化过程中具有高度保守性。系统进化树分析表明,山羊与牛、猪、驴、马及人聚为一支,亲缘关系较近,与非洲蟾蜍、斑马鱼亲缘关系较远。跨膜结构域及亲/疏水性预测结果显示,山羊GATA3蛋白不存在跨膜结构域,为亲水性蛋白。信号肽预测结果表明,该蛋白定位于细胞质中。通过构建山羊GATA3基因慢病毒真核表达载体pLVX-GATA3-IRES-ZsGreen1,细胞水平上转染HEK-293T和山羊耳尖成纤维细胞,过表达GATA3基因,产生绿色荧光信号。本研究结果为山羊GATA3基因功能的研究提供了参考依据,为后续探究GATA3基因在山羊泌乳中的作用奠定了基础。