广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离与培养

试验主要对广西巴马香猪耳皮成纤维细胞的分离和培养进行了研究.利用组织块法能够成功分离培养广西巴马香猪耳皮成纤维细胞,其大小范围在1～3 mm3,去除表皮有利于组织块贴壁和细胞的游出;而采用0.25%胰蛋白酶消化液4℃冷处理过夜,不仅有利于去表皮操作,减少取材处理时间,而且操作时间自由度大.在酶消化法中采用胰蛋白酶消化30 min,胶原酶继续消化30～40 min,能够成功分离培养广西巴马香猪耳皮成纤维细胞.广西巴马香猪皮肤成纤维细胞要经历滞留期、对数期、平台期,分别为0～2 d、2～8 d、8～12 d.     

陆川猪PTTG1基因克隆及序列分析

试验旨在克隆陆川猪PTTG1基因全长CDS序列并对其进行生物信息学分析。利用GenBank公布的猪PTTG1预测序列设计引物,用RT-PCR扩增得到目的基因片段,并用生物信息学软件分析和预测了陆川猪PTTG1基因的理化性质与二级结构。结果表明,陆川猪PTTG1基因全长CDS序列为609 bp,编码202个氨基酸;其核苷酸序列与牛、黑猩猩、人、猕猴、大鼠、小鼠、原鸡和斑马鱼相对应序列同源性分别为90.15%、87.85%、87.52%、87.03%、76.03%、74.38%、55.74%和44.48%;PTTG1基因编码的蛋白无信号肽,属于亲水性蛋白,主要存在于细胞质中,存在16个磷酸化位点。氨基酸系统进化树分析表明,不同物种PTTG1基因在进化过程中具有高度保守性。本研究成功克隆了陆川猪PTTG1基因,为今后研究PTTG1基因在猪早期胚胎发育过程中的作用奠定理论基础。     

慢病毒介导的水牛CD14基因shRNA序列的筛选

研究慢病毒载体介导的RNA干扰对水牛CD14基因表达的影响,设计并筛选具有抑制作用的靶序列。将真核表达载体pDsRed-N1-buffaloCD14转染293细胞株,建立稳定表达水牛CD14基因细胞系。同时设计5条水牛CD14 shRNA(319/421/755/970/1 041)以及1条阴性对照序列(NC-1864),构建慢病毒重组质粒pSicoR-GFP-shRNA。采用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染293T细胞包装慢病毒,并进行滴度测定。最后,通过对慢病毒感染的pDsRed1-N1-buffalo CD14-293细胞进行QRT-PCR检测,筛选具有抑制效果的shRNA。结果显示:在各感染细胞组中,外源水牛CD14基因mRNA的表达均受到不同程度的抑制,其中,CD14 shRNA-970靶点的干扰效率最高,达到79.3%(P<0.01)。成功筛选出具有较高抑制效果的水牛CD14 shRNA靶序列,为研究CD14基因在布氏杆菌所致炎症反应中的作用,建立家畜布氏杆菌病防治新方法奠定了基础。     

猪成纤维细胞转染方法的比较

以EGFP为报告基因,比较脂质体法与磷酸钙法对广西陆川猪胎儿成纤维细胞进行转染的效率.结果发现:利用脂质体法、磷酸钙法转染35 mm培养皿培养的细胞,分别得到15、13个阳性细胞集落.利用2种方法对猪胎儿成纤维细胞进行转染均可行.     

陆川猪MYL2基因生物信息学分析、真核表达载体构建及组织表达研究

【目的】了解陆川猪肌球蛋白轻链2(myosin light chain 2,MYL2)基因CDS区序列及其编码蛋白的结构和功能,探究MYL2基因对肌肉生长发育的影响,为陆川猪的开发利用提供分子基础。【方法】采用RT-PCR技术扩增陆川猪MYL2基因CDS区,利用MegAlign软件对陆川猪MYL2基因与不同物种进行相似性比对和系统进化树构建,并通过生物信息学软件分析MYL2蛋白理化性质、疏水性和跨膜结构等;构建MYL2基因真核表达载体,利用脂质体法将重组质粒转染C2C12细胞并观察荧光;通过实时荧光定量PCR检测MYL2基因在陆川猪不同组织中的表达情况。【结果】陆川猪MYL2基因CDS区全长501 bp,编码166个氨基酸,与NCBI上公布的野猪MYL2基因相似性为99.6%,存在2处突变：156 bp处C突变为T,为同义突变;404 bp处T突变为C,使异亮氨酸(I)突变为苏氨酸(T)。生物信息学分析显示,MYL2蛋白原子总数为2 633个,分子质量为18.879 ku,理论等电点(pI)为4.83,不存在跨膜结构,无信号肽,为非分泌蛋白。MYL2蛋白有16个位点可能会被磷酸化,在第...     

水牛生精上皮细胞的冷冻保存

为探讨水牛睾丸生精上皮细胞冷冻保存的适宜冷冻保护剂及其浓度,在DMEM中分别添加不同浓度的冷冻保护剂二甲基亚砜(DMSO)、甘油(G)、丙二醇(PG)和乙二醇(EG),以及10%的胎牛血清(FBS),对3～5月龄水牛生精上皮细胞进行冷冻保存,解冻后台盼蓝染色测定细胞活率.结果显示,当以0%,5%.10%,15%,20%DMSO添加时,10%DMSO组的细胞解冻后活率均显著高于其他各组(P<0.05);当以0%,20%,25%,30%,35%,40%G添加时,35%G组的细胞解冻后活率均显著高于其他各组(P<0.05);当以0%,5%,10%,15%,20%,25%PG添加时,15%～25%PG各组的细胞解冻后活率均显著高于其他各组(P<0.05),但以20%PG组为最高;当以0%,5%,10%,15%,20%EG添加时,5%～20%EG各组的细胞解冻后活率均显著高于0%EG组,但以10%EG组为最高;而对4种冷冻保护剂各最优浓度组的细胞解冻后活率比较,10%DMSO、35%G组的细胞活率均显著高于20%PG、10%EG组(P<0.05).结果表明,以添加10%DMSO或35%G于含10%FBS的DMEM冷冻液中,采用两步慢速冷冻,液氯保存,37℃水浴1 min解冻,是一种具有较高复苏率的冷冻保存水牛生精上皮细胞的方法.     

水牛精原细胞的体外培养及分化

以探讨水牛精原细胞体外培养的发育潜能为目的,对3～5月龄水牛睾丸组织进行精原细胞与支持细胞的体外共培养.两步酶法消化睾丸组织来制备水牛生殖细胞悬液,接种于含10%FBS的DMEM培养液中,在37℃、5%CO2、饱和湿度下培养30 d,观察细胞的生长和形态变化,并对培养4周的细胞进行RT-PCR分析,以检测PRM-2和TP-1基因的表达情况.结果显示,水牛精原细胞体外培养24 h后,精原细胞(10.0～12.5μm)呈圆形并紧贴支持细胞上;养7～8 d后.精原细胞出现聚集状态;养10 d后,有细胞克隆形成;养30 d后,出现似长形精子细胞(8.0～10.0μm).对培养4用后的细胞进行RT-PCR分析,精子细胞特异表达基因PRM-2被检测出来.结果表明,采用本试验体外培养条件对水牛精原细胞进行培养,能够满足精原细胞体外长期培养的需要,并可以发生增殖与分化而形成似精子细胞.     

水牛支持细胞体外分离及培养

试验探讨了水牛(Bubalus bubalus Linnaeus)睾丸支持细胞(Sertolicell,SC)的分离、纯化以及培养过程中的形态学特性。结果发现,采用差异黏附培养法和高温培养法(38.5℃培养24h)纯化后,支持细胞的纯度达到了90%,说明差异黏附培养法和高温培养法均可用于纯化水牛睾丸支持细胞。     

广西2个地方猪种与杜洛克猪杂交后代生长及繁殖性能分析

[目的]研究杜洛克猪和环江香猪、隆林猪杂交后代的繁殖性能和生长性能,为优良性状新品系猪的选育工作提供基础依据.[方法]通过杜洛克猪♂×环江香猪♀和杜洛克猪♂×隆林猪♀杂交分别获得杂交后代杜香猪和杜隆猪,测定杜香猪、杜隆猪的体长、体高、胸围、腹围、体重等生长性能,记录母猪窝产仔数、窝产活仔数、初生窝重及其仔猪30日龄断奶头数、30日龄断奶窝重等繁殖性能.[结果]杜香猪和杜隆猪的生长性能和繁殖性能均较优良,杂交后代集中了环江香猪、隆林猪和杜洛克猪的优良性状.[结论]利用广西地方猪种来培育优良性状新品系猪,环江香猪和隆林猪可作为良种的二元杂交母本使用.     

陆川猪CSRP3基因克隆及其组织表达差异分析

【目的】克隆陆川猪的富含半胱氨酸和甘氨酸蛋白3(CSRP3)基因,并对其进行生物信息学和组织表达谱分析,为研究CSRP3基因在陆川猪肌肉生长过程中的作用机制打下基础。【方法】根据NCBI已公布的野猪CSRP3基因序列设计特异性定量引物和克隆引物,运用RT-PCR克隆CSRP3基因并进行生物信息学在线分析,采用实时荧光定量PCR检测CSRP3基因在陆川猪各组织中的表达差异。【结果】陆川猪CSRP3基因编码区(CDS)全长854 bp,编码194个氨基酸残基,与NCBI已公布的野猪CSRP3基因CDS序列相比存在5处同义碱基突变,且陆川猪与野猪氨基酸序列相似性达100.0%;陆川猪CSRP3基因的编码蛋白分子量为20935.82 Da,分子式为C₉₆₄H₁₄₀₄N₂₆₂O₂₇₄S₁₉,理论等电点(pI)为8.89,不稳定系数为39.11,表明其是偏碱性的稳定蛋白;CSRP3蛋白二级结构主要由无规则卷曲构成,三级结构可能有一种模型;陆川猪CSRP3蛋白除有多个磷酸化位点之外,无跨膜结构和信号肽;陆川猪CSRP3基因在心脏中表达量最高,背最长肌次之,在肝脏中的表达量最低。【结论】CSRP3基因在陆川猪心脏中表达量最高,背最长肌次之且明显高于其他组织,说明该基因可能对肌肉生长有一定影响。