慢病毒介导的水牛CD14基因shRNA序列的筛选

研究慢病毒载体介导的RNA干扰对水牛CD14基因表达的影响,设计并筛选具有抑制作用的靶序列。将真核表达载体pDsRed-N1-buffaloCD14转染293细胞株,建立稳定表达水牛CD14基因细胞系。同时设计5条水牛CD14 shRNA(319/421/755/970/1 041)以及1条阴性对照序列(NC-1864),构建慢病毒重组质粒pSicoR-GFP-shRNA。采用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染293T细胞包装慢病毒,并进行滴度测定。最后,通过对慢病毒感染的pDsRed1-N1-buffalo CD14-293细胞进行QRT-PCR检测,筛选具有抑制效果的shRNA。结果显示:在各感染细胞组中,外源水牛CD14基因mRNA的表达均受到不同程度的抑制,其中,CD14 shRNA-970靶点的干扰效率最高,达到79.3%(P<0.01)。成功筛选出具有较高抑制效果的水牛CD14 shRNA靶序列,为研究CD14基因在布氏杆菌所致炎症反应中的作用,建立家畜布氏杆菌病防治新方法奠定了基础。     

水牛脂多糖结合蛋白基因表达载体构建及其shRNA片段的筛选

试验旨在构建水牛脂多糖结合蛋白(LBP)基因融合蛋白表达载体,探讨其在293细胞中的表达情况;筛选获得可抑制水牛LBP基因表达的shRNA干扰片段。采用RT-PCR方法,以水牛肝脏cDNA为模板,扩增水牛LBP开放阅读框(ORF),将其连接到pMD18-T载体中。序列测定并分析正确后,采用SalⅠ和BamHⅠ进行双酶切,将水牛LBP基因编码区定向克隆至pDsRed-N1载体中,构建其融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP。设计2个针对LBP靶基因序列的shRNA(774-792、1212-1231),同时设计无关序列1864作为阴性对照。合成好的shRNA序列先退火连接到pUC 57载体上,再亚克隆到慢病毒表达载体pSicoR-GFP中,将重组质粒命名为pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C),采用PCR和测序方法鉴定阳性克隆。将LBP融合蛋白表达载体和其shRNA慢病毒表达载体经脂质体共转染293细胞,48 h后观测荧光蛋白表达情况。收集共转染细胞样品,采用实时定量PCR(QRT-PCR)检测LBP基因的表达,筛选有效抑制LBP基因表达的shRNA干扰序列。结果表明,成功构建水牛LBP融合蛋白表达载体pDsRed-N1-LBP,并在293细胞中瞬时表达。PCR和测序结果均证实所构建的shRNA慢病毒表达载体pSicoR-GFP-shLBP774/1212/1864(N.C)为阳性克隆。共转染48 h后观测,红色和绿色荧光蛋白均有表达。QRT-PCR检测结果显示,shRNA-774和shRNA-1212对293细胞中LBP基因mRNA的表达均有抑制效果,抑制效率分别为49.53%、29.27%。因此,设计合成的2条shRNA序列能有效抑制水牛LBP基因的表达,这为进一步探讨LBP基因在LPS诱导的革兰氏阴性菌跨膜机制和信号转导中的作用机理研究奠定了基础。     

关于农业技术推广体制改革的初探

农业技术推广是推动农业经济发展的重要支柱。针对我国现行农业技术推广体制存在的问题,必须加强政府对农技推广的支持,深化农业技术推广机制改革,创新农业技术推广组织,形成社会化的农业技术服务体系,以适应新时期农业经济发展的需要。     

水牛SOX2基因5'调控序列的克隆与功能分析

为探讨水牛SOX2基因的转录调控机制,本试验克隆获得其长2555 bp 的5'调控序列片段,结合生物信息分析设计了-2263、-1816、-1275、-660和-407 bp 5个缺失体,并分别构建其EGFP表达报告载体,通过生产转基因早期胚胎和转染水牛胎儿成纤维细胞分析各缺失体片段的转录活性。结果发现,除-407 bp以外的各缺失体在猪4.5 d早期胚胎细胞中均能成功启动下游EGFP的表达,且随着片段缩短,其转录活性呈极显著递减趋势(P<0.01);而转染水牛成纤维细胞48 h后,除p-407-EGFP以外的各缺失体报告载体转染组均观察到少数细胞发光,转录活性两两之间差异均极显著(P<0.01),转录活性从高到底排布分别为-2263、-660、-1275和-1816 bp。p-407-EGFP载体在胚胎水平和细胞水平均未观察到荧光。以上结果表明,-660~-407 bp是构成水牛SOX2基因表达不可缺失的部分,-2263~-1816 bp中有非多能细胞特异性的增强子元件存在,而-1816~-1275 bp和-1275~-660 bp均含有多能性细胞特异性的增强子元件。