水牛Oct4、Nanog基因的克隆及其在水牛胎儿成纤维细胞中的表达

【目的】转录因子Oct4、Nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子,在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体,并在水牛体细胞中表达,为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用,以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系（iPSC）奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA,将RNA反转录成第1链cDNA,参照牛基因序列（Oct4：NM_174580,Nanog：NM_001025344）设计特异性引物,采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和Nanog的编码区序列（the coding sequences,CDS）和DNA全长序列,其中Oct4全长DNA分3段扩增,Nanog全长DNA分2段扩增;利用生物在线分析软件对水牛Oct4和Nanog进行蛋白质结构预测和同源性比对;采用EcoRⅠ、XholⅠ和XholⅠ、NotⅠ双酶切,T4连接酶,将Oct4和Nanog的CDS连接到逆转录病毒载体pMX上,构建逆转录表达载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;采用组织块法培养水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts,BFFs）,逆转录表达系统经过病毒包装后产生的病毒上清液感染BFFs,感染12-15h后,继续培养48 h;通过RT-PCR和免疫荧光技术检测转基因在BFFs中的表达情况。【结果】Oct4 CDS全长1 083 bp,编码361个氨基酸,DNA全长4 509 bp,包括5个外显子和4个内含子;Nanog CDS全长903 bp,编码301个氨基酸,DNA全长4 473 bp,包括4个外显子和3个内含子;将Oct4和Nanog基因序列提交到GenBank,分配的基因登录号分别为JN991003和JN991004;Oct4氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为98%、96%、91%和81%,Nanog氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为90%、81%、69%和47%;Oct4和Nanog蛋白结构与小鼠相应蛋白的结构相似,分别含有本家族特有的POU结构域和HOX同源结构域;成功构建表达Oct4和Nanog的逆转录病毒载体pMX-Oct4和pMX-Nanog;逆转录病毒系统pMX介导的Oct4和Nanog基因能转入BFFs中,在mRNA水平和蛋白水平都表达,阴性对照中不表达。【结论】分别克隆了水牛Oct4和Nanog的DNA序列全长和CDS,其基因序列和氨基酸序列在物种间高度保守;逆转录病毒转基因方法将Oct4和Nanog基因成功地转入BFFs并表达。逆转录病毒系统介导目的基因表达的转基因方法可以应用于水牛转基因研究和水牛iPSC生产。     

长江三角洲生态系统服务价值分析及趋势预测

[目的]对长江三角洲生态系统服务价值进行分析及趋势预测,以期为该区未来城市发展以及制定生态环境建设补偿政策提供支持。[结果]以长江三角洲16个地市2000—2014年的土地利用数据和相关统计资料为数据源,采用Costanza生态系统服务价值计算方法,参照修正后的生态系统单位面积生态服务价值系数,结合敏感性分析,探讨生态系统服务价值的时空演化规律,并利用马尔科夫模型对其未来3a的发展趋势进行了预测分析。[结果]区域生态系统总服务价值从2000年的1 303.89亿元减少到2014年的1 294.25亿元,变化率为-0.74%,水源涵养、废物处理和娱乐文化生态系统服务功能价值上升;在空间上,常州、南京、宁波、泰州、台州、扬州的生态系统服务价值不断增加,而其他城市的则处于下降趋势;对长江三角洲2015和2017年的土地利用构成和生态系统服务价值进行预测,呈现耕地、林地持续减少,建设用地持续增加的趋势,生态系统总服务价值将减少276.65亿元。[结论]在未来土地调整中应更多地考虑到生态服务价值的重要意义,格外注意对耕地、水域的保护,控制建设用地占用耕地和林地,继续加大植树造林力度,提高土地利用集约度,维持生态系统的功能。     

不同逆转录载体系统应用于水牛胎儿成纤维细胞转基因的探索

采用2种不同的逆转录病毒载体系统（pMX和pMSCV）,构建携带绿色荧光蛋白（EGFP）基因的重组载体,探索能高效感染水牛胎儿成纤维细胞（BFFs）的病毒系统和感染方法.结果发现,2种逆转录病毒系统包装出的重组病毒滴度都能达到10⁶,将pMX病毒系统生产的重组病毒经超速离心浓缩后,滴度可达到10⁷;2种重组病毒都能感染BFFs,但pMX系统比pMSCV系统更能有效地感染BFFs;通过对病毒的感染方式进行比较,发现使用新鲜病毒连续感染BFFs 2次（每次间隔12 h）,或者经过超速离心浓缩后的病毒感染BFFs 1次,可以显著提高感染效率.     

水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子的克隆与鉴定

[目的]获得有效的水牛RNA聚合酶Ⅲ启动子序列,为开展水牛源细胞的基因特异沉默研究奠定基础.[方法]通过启动子上、下游保守序列对水牛源启动子7SK、U6进行克隆和启动子关键顺式作用元件识别,利用一段针对EGFP的shRNA片段（shEGFP）对水牛7SK、U6启动子进行功能性分析,然后分别在水牛源及鼠源细胞中与pEGFP-N1共转染,转染48h后用荧光显微镜检测EGFP的表达情况,并用流式细胞仪和荧光实时定量PCR检测EGFP沉默表达情况.[结果]克隆获得水牛7SK、U6启动子序列分别为430和357 bp,其OCT-1（或CACCC盒）及TATA盒高度保守.连接shEGFP后与pEGFP-N1共转染细胞,通过荧光显微镜可观察到细胞发生了明显的荧光表达沉默现象;通过流式细胞分析,发现水牛7SK和U6启动子引导的shEGFP在水牛源细胞中沉默效率高达93.82％和87.45％;荧光实时定量PCR检测结果显示,在转染bu7SK-shEGFP和buU6-shEGFP的水牛源BFF细胞中,EGFP表达水平均显著低于其他物种启动子的细胞转染组（P＜0.05）,而在鼠源PT67细胞中,水牛启动子的启动效率与其他物种启动子差异不显著（P＞0.05）.[结论]水牛7SK和U6启动子可高效启动shRNA表达,且具有一定的物种特异性.     

ICSI介导生产转基因牛胚胎影响因素的研究

采用牛体外成熟卵母细胞和冷冻解冻的精子为材料,以pEGFP-N1为模式基因,探讨DNA浓度、精子质膜破损方法、注射台温度对牛精子胞质内注射（ICSI）介导转基因效果的影响。结果表明：线性pEGFPN1质粒DNA浓度为5μg/mL、10μg/mL两组的早期胚胎发育率显著高于50μg/mL组（19.8%,16.7%VS 7.9%,p〈0.05）。以冻融、TritonX100、超声波断尾三种方法破损精子质膜,冻融组的囊胚发育率（24.7%）最高,且冻融组的早期胚胎基因表达率极显著高于超声断尾组（41%VS 20.5%,p〈0.01）;当分别在25℃、38℃的注射台进行显微注射时,两组之间胚胎的囊胚率无显著差异（p〉0.05）,但二者之间胚胎的基因表达率差异显著（46.83%VS 28.57%,p〈0.05）。以上结果表明：（1）牛精子转染外源GFP基因的浓度不宜过高,转染高浓度的DNA会影响胚胎发育;（2）精子质膜是阻碍外源DNA与牛精子相结合的主要因素,将精子冻融处理可有效破损其质膜,利于精子与外源DNA的结合,从而提高ICSI介导转基因效率;（3）25℃和38℃热台温度对牛ICSI胚胎的早期发育无影响,但25℃热台温度可提高牛ICSI介导转基因的效果。     

长江三角洲生态系统服务重要性空间分布特征评价

选择生物多样性保护、土壤保持、水源涵养3种生态系统服务功能,建立适用于长江三角洲地区的自然生态系统服务重要性评价模型与方法,利用变异系数法确定权重,将生态系统服务重要性划分为极重要、中等重要、比较重要和一般重要4个等级,综合评价长江三角洲地区的生态功能重要性及其空间分布特征。结果表明:长江三角洲地区生物多样性保护以极重要区为主,占49. 17%,包括上海市、杭州市、宁波市、嘉兴市、绍兴市、台州市等;水源涵养以一般重要区为主,占42. 52%,包括上海市、南通市、扬州市、泰州市和苏州市;土壤保持以比较重要区为主,占48. 24%,包括杭州市、南京市、常州市、无锡市、镇江市和嘉兴市等。综合评价结果以比较重要区面积最大,占35. 99%,大部分城市均有分布;中等重要区占24. 4%,主要分布在泰州市、台州市、嘉兴市、宁波市、湖州市、绍兴市等;极重要区占21. 85%,主要分布在宁波市南部、杭州市和绍兴市等。     

水牛胚胎生殖干细胞饲养层体系的建立

本试验对水牛胚胎生殖干细胞饲养层体系建立进行了研究。首先比较了组织块法和酶消化法培养水牛胎儿成纤维细胞的差异;其次探讨丝裂霉素处理水牛胎儿成纤维细胞的有效时间;最后以建立的饲养层体系培养水牛胚胎生殖干细胞。结果表明：（1）组织块法培养的细胞状态优于酶消化法,组织块培养法更适于水牛胎儿成纤维细胞的分离培养;（2）第三代的水牛胎儿成纤维细胞核型正常,状态良好,可用于饲养层的制备;（3）通过MTT和Brdu法检测,确定10mg／L的丝裂霉素C处理水牛胎儿成纤维细胞3．5h能有效抑制成纤维细胞增殖且细胞形态良好;（4）在本试验条件下制备的饲养层能有效维持水牛胚胎生殖千细胞至8代。     

水牛miR-302s真核表达载体的构建及生物信息学分析

试验旨在克隆并构建水牛miR-302s慢病毒真核表达载体（bbu-miR-302s）,对其进行生物信息学分析,并尝试将该载体应用于水牛体细胞重编程中。以水牛基因组DNA为模板扩增得到bbu-miR-302s前体序列,测序正确后将其连入pLVX-IRES-ZsGreen1构建重组慢病毒真核表达载体。重组的慢病毒真核表达载体经过酶切鉴定正确后,采用脂质体转染方法包装慢病毒颗粒,通过感染HEK-293T细胞及猪和水牛体细胞,检测重组慢病毒载体的有效性。bbu-miR-302s有效感染水牛胎儿成纤维细胞（BFF）后,经诱导培养,检测能否产生水牛诱导多能干细胞（iPSC）。采用CoGeMiR数据库查询法和SnapGene Viewer软件进行miR-302s家族在基因组中的定位分析;利用ClustalX 1.83软件分析miR-302s序列保守性;利用TargetScan和miRWalk软件预测bbu-miR-302s主要的靶基因,并运用DAVID程序对靶基因进行信号通路富集。测序结果显示,扩增获得的序列是水牛miR-302s家族,包装的重组慢病毒滴度为7.2×10⁶TU/mL,并可以有效感染3个物种的体细胞。bbu-miR-302s病毒感染BFF后,细胞经历形态变化并发生聚集形成克隆样,碱性磷酸酶检测阳性,但多能基因及表面抗原检测结果均为阴性,说明单因子miR-302s不足以完全重编程BFF为水牛iPSC,但促进了重编程进程。CoGeMiR数据库检索发现,miR-302s家族主要位于LARP7基因的内含子区;SnapGene Viewer软件进一步分析发现,bbu-miR-302s位于水牛7号染色体LARP7基因的内含子区。序列同源性分析表明,miR-302s家族成员间及miR-302s簇成员在不同物种间均高度保守。水牛miR-302s主要靶基因共255个,这些靶基因主要集中在33个信号通路中,其中PGK信号通路与胰高血糖素信号转导及调控干细胞信号通路最为显著。本研究结果为后续开展miR-302s簇在体细胞重编程中的作用奠定基础。     

供体细胞低温冷藏处理对水牛体细胞核移植效果的影响

自1997年《自然》杂志报道克隆羊“多莉”以来,多种哺乳动物的体细胞核移植相继取得了成功。然而,体细胞核移植的技术环节繁多,各种各样的因素影响着核移植的效果,核移植的效率仍然很低(牛,<5%)[1]。核移植效率的提高有赖于各个技术环节的完善,供体细胞的准备与处理是核移植中的一个关键环节,它直接影响到核移植的效果。低温冷藏供体细胞可以减少染色体变异的可能性,亦有利于重构胚的发育。研究探讨了水牛胎儿成纤维细胞经低温冷藏处理后对核移植效果的影响。1材料与方法1.1试剂及培养液的配制研究所用的试剂除TCM-199购自G ibco公司外,其…