水牛Oct4、Nanog基因的克隆及其在水牛胎儿成纤维细胞中的表达

【目的】转录因子Oct4、Nanog是调节干细胞多能性相关的转录因子，在干细胞的分化和胚胎发育中有重要作用。本研究旨在克隆水牛Oct4和Nanog基因、分析基因序列和蛋白结构、构建逆转录表达载体，并在水牛体细胞中表达，为进一步研究其在水牛早期胚胎发育中的作用，以及为建立水牛胚胎干细胞系和诱导多能干细胞系（iPSC）奠定基础。【方法】分别从水牛生殖嵴和体细胞中提取RNA和DNA，将RNA反转录成第1链cDNA，参照牛基因序列（Oct4：NM_174580，Nanog：NM_001025344）设计特异性引物，采用RT-PCR和PCR分别扩增Oct4和Nanog的编码区序列（the coding sequences，CDS）和DNA全长序列，其中Oct4全长DNA分3段扩增，Nanog全长DNA分2段扩增；利用生物在线分析软件对水牛Oct4和Nanog进行蛋白质结构预测和同源性比对；采用EcoRⅠ、XholⅠ和XholⅠ、NotⅠ双酶切，T4连接酶，将Oct4和Nanog的CDS连接到逆转录病毒载体pMX上，构建逆转录表达载体pMX-Oct4和pMX-Nanog；采用组织块法培养水牛胎儿成纤维细胞（buffalo fetal fibroblasts，BFFs），逆转录表达系统经过病毒包装后产生的病毒上清液感染BFFs，感染12—15h后，继续培养48 h；通过RT-PCR和免疫荧光技术检测转基因在BFFs中的表达情况。【结果】Oct4 CDS全长1 083 bp，编码361个氨基酸，DNA全长4 509 bp，包括5个外显子和4个内含子；Nanog CDS全长903 bp，编码301个氨基酸，DNA全长4 473 bp，包括4个外显子和3个内含子；将Oct4和Nanog基因序列提交到GenBank，分配的基因登录号分别为JN991003和JN991004；Oct4氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为98%、96%、91%和81%，Nanog氨基酸序列与牛、猪、人和鼠相应氨基酸的同源性分别为90%、81%、69%和47%；Oct4和Nanog蛋白结构与小鼠相应蛋白的结构相似，分别含有本家族特有的POU结构域和HOX同源结构域；成功构建表达Oct4和Nanog的逆转录病毒载体pMX-Oct4和pMX-Nanog；逆转录病毒系统pMX介导的Oct4和Nanog基因能转入BFFs中，在mRNA水平和蛋白水平都表达，阴性对照中不表达。【结论】分别克隆了水牛Oct4和Nanog的DNA序列全长和CDS，其基因序列和氨基酸序列在物种间高度保守；逆转录病毒转基因方法将Oct4和Nanog基因成功地转入BFFs并表达。逆转录病毒系统介导目的基因表达的转基因方法可以应用于水牛转基因研究和水牛iPSC生产。

Cloning of Buffalo (Bubalus bubalis) Oct4 and Nanog Genes and Ectopic Expression in Buffalo Fetal Fibroblasts