西农萨能羊泌乳高峰期和初期乳腺组织差异表达基因研究

利用抑制性削减杂交和实时定量PCR研究西农萨能羊泌乳高峰期差异表达基因,结果表明成功构建泌乳高峰期和泌乳初期乳腺组织差异表达削减eDNA文库,以GAPDH为指标检测文库削减效率为2^5倍,共获得78个阳性克隆,PCR检测插入片段主要分布在150～1000bp,挑选插入片段不等的30个克隆测序,获得25个有效序列,代表18个基因。对文库中所包含的血清淀粉样蛋白A3（SAA3）,ATP结合盒亚家族G成员2（ABCG2）,心脏型脂肪酸结合蛋白（H-FABP）和黄嘌呤脱氢酶（XDH）进行实时定量PCR检测,发现上述4个基因在泌乳高峰期乳腺组织中的表达水平分别是泌乳初期的17．0,7．7,16．3和1．7倍。结论：构建的消减文库可用于筛选泌乳高峰期差异基因,已鉴定的4个基因很可能是调控产奶量和乳成分变化的候选基因。     

水牛PNPLA8基因编码区克隆、表达分析及催乳素对该基因的调节作用

为了探究磷脂酶patatin样域包含蛋白8（patatin-like phospholipase domain containing 8,PNPLA8）在水牛乳腺脂质代谢中的作用,试验根据GenBank中公布的奶牛PNPLA8基因序列（登录号：XM_005205444.4）设计引物,应用PCR扩增并克隆水牛PNPLA8基因编码区（CDS）,应用生物信息学软件分析序列及蛋白质结构;抽提水牛不同组织及不同泌乳期乳腺组织RNA,利用实时荧光定量PCR检测PNPLA8基因在不同组织间和不同泌乳期的表达;利用不同浓度的催乳素处理水牛乳腺上皮细胞,通过定量检测催乳素对PNPLA8基因表达的影响。结果显示,水牛PNPLA8基因CDS长2 355 bp,编码784个氨基酸,与牦牛、山羊等PNPLA8基因具有较高的同源性;PNPLA8基因在所检测的水牛11个组织中有不同水平的表达,在肺脏和乳腺中表达量相对较高,在脂肪和肌肉组织中表达量较低;在整个泌乳期内PNPLA8基因的表达呈现"低-高-低"趋势;催乳素处理水牛乳腺上皮细胞结果显示,随着催乳素浓度升高,PNPLA8基因表达量逐渐下降。本研究成功克隆了水牛PNPLA8基因,并发现PNPLA8基因是参与乳腺泌乳的一个功能基因,为进一步研究PNPLA8基因在水牛乳腺中的功能奠定基础。     

兔TLR2、TLR3和TLR4部分cDNA序列的克隆及分析

用RT-PCR技术从日本大耳白兔脾脏组织克隆出兔Toll样受体2、3、4基因（拟命名为RTLR2、R TLR3和RTLR4）的cDNA序列并进行测序,获得的3个Toll样受体基因序列长分别为128、150和139bp,并将其测序结果与GenBank中登录的穴兔（Oryctolagus cuniculus）的Toils核苷酸序列进行比对,发现本次克隆到的RTLR2与穴兔TLR2的基因序列（NM_001082781）相似性为99％,而RTLR3与TLR3（NM_001082219）和RTLR4与TLR4（NM_001082732）相似性均为100％。Protein Blast同源性结果显示,RTLR2、RTLR3和RTLR4的氨基酸序列与穴兔TLR2、TLR3和TLR4的同源性皆为100％,与马、人、野猪等其他8种动物TLRs的比较,与RTLR2同源性最高的是马的80％,其他的只有61％～78％;与RTLR3同源性最高是马和野猪的97％,其他也较高达93％～95％;而RTLR4与其他8种动物的同源性均较低75％以下。结果表明：RTLR2、RTLR3和RTLR4分别为免TLR2、TLR3和TLR4的部分cDNA基因序列;TLRs在不同物种的进化过程中存在种属特异性。     

西农萨能羊凝乳酶原前体cDNA的克隆与序列分析

参照GenBank登录的绵羊凝乳酶原前体cDNA序列设计引物,以新生5d的西农萨能羊皱胃组织总RNA为模版,通过RT-PCR方法获得凝乳酶原前体cDNA,克隆测序后进行序列比对。结果表明,克隆基因为B型凝乳酶,该基因cDNA具有1292个碱基,编码381个氨基酸,包含16个氨基酸的信号肽序列和42个氨基酸的酶原序列。将其与已报道的山羊、绵羊和牛的凝乳酶原前体序列进行比对,发现核苷酸同源性分别为99.41%、98.74%和95.29%,氨基酸同源性为99.21%、98.42%和93.70%。     

西农萨能奶山羊SERPINA1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在克隆西农萨能奶山羊SERPINA1基因的CDS区,采用生物软件和在线预测工具进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR技术检测SERPINA1基因在西农萨能奶山羊各组织间mRNA的表达水平。根据GenBank中山羊SERPINA1基因CDS区序列（登录号：XM_018066209.1）,利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,RT-PCR扩增目的基因,构建原核表达载体测序后对序列进行生物信息学分析;采集西农萨能奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、乳腺、肾脏、肌肉、瘤胃和小肠组织,提取组织RNA,反转录为cDNA模板,设计特异性定量引物,进行实时荧光定量PCR,检测SERPINA1基因在不同组织中的表达差异。结果显示,西农萨能奶山羊SERPINA1基因CDS区全长1 326 bp,编码441个氨基酸;同源性比对分析显示,西农萨能奶山羊与山羊、绵羊、牛和小鼠SERPINA1基因核苷酸序列同源性分别为100%、98.6%、95.7%和71.6%,与山羊亲缘关系最近,其次是绵羊。SERPINA1蛋白分子质量为48.71 ku,等电点为5.71,为跨膜亲水蛋白;SERPINA1氨基酸序列分别有62个磷酸化位点,3个跨膜区结构。组织表达分析显示,SERPINA1基因在西农萨能奶山羊肝脏组织中显著高表达（P<0.05）,其次是乳腺组织,在肺脏组织中表达量最低。研究结果为进一步探究SERPINA1基因在奶山羊乳蛋白合成代谢中的作用提供理论依据。     

芦花鸡IFITM3基因克隆及生物信息学分析

本研究旨在对芦花鸡的干扰素诱导的跨膜蛋白-3（interferon-induced transmembrane protein 3，IFITM3）基因进行克隆及生物信息学分析。根据GenBank中鸡IFITM3基因序列（登录号：NM_001350061.1）设计特异性引物，利用RT-PCR技术对芦花鸡IFITM3基因进行克隆、测序和生物信息学分析。结果表明，芦花鸡IFITM3基因片段大小为414 bp，与GenBank中发表的鸡IFITM3基因序列（登录号：NM_001350061.1）同源性为99.9%；编码137个氨基酸。IFITM3基因理论分子质量为14.95 ku，理论等电点（pI）为6.89，不稳定系数为33.98，脂肪系数为103.14，平均疏水指数为0.300，存在3个明显的疏水区，无信号肽，存在2个跨膜区，分别位于第46-68、101-123位氨基酸处；二级结构预测显示，IFITN3蛋白主要以无规则卷曲为主，存在多个α-螺旋和β-折叠区域。本研究成功克隆了芦花鸡IFITM3基因，为进一步研究IFITM3蛋白功能及阐明其抗病毒分子机制奠定了理论基础。     

日本大耳白兔TLR3部分cDNA克隆及mRNA在组织中的分布

采用RT—PCR技术从日本大耳白兔的脾脏组织克隆出兔的Toll样受体基因3（命名为。TLR3），并对其mRNA在兔的17种组织中的分布情况进行了检测。结果显示，RTLR3核苷酸序列与GenBank中登载的穴兔（Oryctolagus cuniculus）TLR3序列（登录号：NM_001082219）相似性为100％；兔的胸腺、脾脏、睾丸等14种组织中检测出TLR3 mRNA的转录产物，而在骨骼、胃和皮肤中未能发现。推导的氨基酸序列同源性比对表明，兔TLR3与人、野猪、牛、猫、褐鼠等动物的同源性最高，为80％-85％；与原鸡同源性次之，为61％；与草鱼、绿河豚等同源性在45％～48％之间；系统进化树分析表明，兔TLR3与马的亲缘关系最接近，与猪、人／绵羊、牛、猩猩／猫的亲缘关系依次渐远，与鼠的亲缘关系最远。可见，TLR3在不同种属动物及不同组织中所起的作用具有生物多样性。     

西农萨能奶山羊SERPINA1基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在克隆西农萨能奶山羊SERPINA1基因的CDS区,采用生物软件和在线预测工具进行生物信息学分析,通过实时荧光定量PCR技术检测SERPINA1基因在西农萨能奶山羊各组织间mRNA的表达水平。根据GenBank中山羊SERPINA1基因CDS区序列(登录号:XM_018066209.1),利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物,RT-PCR扩增目的基因,构建原核表达载体测序后对序列进行生物信息学分析;采集西农萨能奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、乳腺、肾脏、肌肉、瘤胃和小肠组织,提取组织RNA,反转录为cDNA模板,设计特异性定量引物,进行实时荧光定量PCR,检测SERPINA1基因在不同组织中的表达差异。结果显示,西农萨能奶山羊SERPINA1基因CDS区全长1 326 bp,编码441个氨基酸;同源性比对分析显示,西农萨能奶山羊与山羊、绵羊、牛和小鼠SERPINA1基因核苷酸序列同源性分别为100%、98.6%、95.7%和71.6%,与山羊亲缘关系最近,其次是绵羊。SERPINA1蛋白分子质量为48.71 ku,等电点为5.71,为跨膜亲水蛋白;SERPINA1氨基酸序列分别有62个磷酸化位点,3个跨膜区结构。组织表达分析显示,SERPINA1基因在西农萨能奶山羊肝脏组织中显著高表达(P0.05),其次是乳腺组织,在肺脏组织中表达量最低。研究结果为进一步探究SERPINA1基因在奶山羊乳蛋白合成代谢中的作用提供理论依据。     

大熊猫γ-干扰素基因的克隆与序列分析

本实验应用反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术,从ConA诱导培养的大熊猫外周血淋巴细胞总RNA中扩增得到大熊猫γ-干扰素基因（GenBank accession No：DQ630727）,并将其克隆到pGEM-T载体中。经菌落PCR鉴定、序列测定与序列分析,结果表明,经克隆得到的IFN-1基因开放阅读框由498个核苷酸组成,编码一个由166个氨基酸组成的多肽,包括编码19个氨基酸的信号肽和147个氨基酸的成熟肽,预测蛋白分子量和等电点分别约为20Ku和9．36。与GenBank中其他哺乳动物的IFN-γ基因比较,它与犬、猫、人、猪、牛、羊、马、兔、鼠等的核苷酸序列同源性在57.7％（鼠）-93．2％（犬）之间;IFN-γ编码氨基酸序列同源性在46．8％（鼠）-92．8％（犬）之间;进化树构建结果表明大熊猫与犬的遗传距离最近。     

关中奶山羊FGF2基因克隆、生物信息学分析及组织表达研究

【目的】对关中奶山羊成纤维细胞生长因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）基因进行克隆及生物信息学分析，并检测其在山羊各组织中的表达差异，为后续探究该基因的功能奠定基础。【方法】以关中奶山羊乳腺cDNA为模板，采用RT-PCR技术扩增并克隆关中奶山羊FGF2基因完整CDS区序列，进行相似性比对、系统发育树构建及生物信息学分析；运用实时荧光定量PCR方法检测FGF2基因在关中奶山羊心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢组织中的表达情况。【结果】关中奶山羊FGF2基因编码区长468 bp，可编码155个氨基酸，分子质量为17.26 ku，理论等电点为9.58，其中含量最高的是甘氨酸，占10.3%。相似性比对结果表明，关中奶山羊FGF2氨基酸序列与人、牛、马、兔、绵羊、虎鲸和野猪的相似性分别为98.7%、99.4%、100.0%、98.7%、99.4%、99.4%和62.6%。系统进化树显示，FGF2基因在不同物种间具有高度保守性，与马的亲缘关系最近。关中奶山羊FGF2蛋白不稳定指数为38.39，属于稳定亲水性蛋白质，不含跨膜结构和信号肽；FGF2蛋白二级结构含有α-螺旋、β-转角、延伸链、无规则卷曲，分别占比10.32%、14.19%、30.97%、44.52%。蛋白质互作预测分析显示，FGF2蛋白与FGFR、KDR、FGF1、FGFR4、MET和FGFR1等与乳腺生长发育相关的蛋白存在相互作用。实时荧光定量PCR检测到关中奶山羊FGF2基因在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、背最长肌、肺脏、乳腺和卵巢中均有表达，在乳腺中表达水平最高，其次为卵巢，在背最长肌中的表达水平最低。【结论】关中奶山羊FGF2基因CDS区序列长468 bp，编码155个氨基酸，为亲水蛋白，二级结构以延伸链和无规则卷曲为主。FGF2基因在关中奶山羊泌乳高峰期的不同组织中均有表达。本试验结果为进一步探究FGF2基因在关中奶山羊乳腺发育中的作用及其具体功能提供了参考。     

奶山羊CIDEa基因的克隆、序列分析与组织表达

为获得奶山羊CIDEa基因序列并检测其在乳腺组织中的表达,采用RT-PCR技术从奶山羊乳腺组织扩增CIDEa基因序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并采用荧光定量PCR检测CIDEa在干奶期和不同泌乳时期乳腺组织中的表达。结果表明:通过克隆测序得到奶山羊CIDEa基因CDS区660 bp,编码219个氨基酸,与GenBank公布的绵羊、牛、人和猪的核苷酸序列同源性分别为99%、96%、85%、85%。奶山羊CIDEa蛋白属于碱性、不稳定亲水蛋白,不存在跨膜结构和信号肽;蛋白主要定位在细胞质、线粒体和细胞核。CIDEa蛋白结构主要由α螺旋、β折叠和不规则卷曲组成。奶山羊CIDEa在泌乳前期、盛期和中期乳腺组织中表达量均显著高于干奶期(P<0.05)。说明CIDEa可能参与奶山羊乳腺的泌乳过程,为进一步研究其在奶山羊乳腺组织中的功能及对乳品质的调控作用奠定基础。     

奶山羊短链脂肪酸受体GPR41基因的克隆及组织表达分析

旨在克隆奶山羊GPR41(G protein-coupled receptor 41)基因并分析其组织表达谱,为进一步探讨其功能奠定基础.根据GenBank上已登录的牛、人和鼠的GPR41基因序列设计1对特异性引物,采用RT-PCR方法克隆奶山羊GPR41基因,利用实时荧光定量PCR方法分析奶山羊GPR41 mRNA表达的组织特异性.测序结果表明奶山羊GPR41基因的CDS区为978 bp,共编码325个氨基酸.奶山羊GPR41基因序列同源性分析表明:其与牛、人和鼠的核苷酸序列同源性分别为96％、78％和74％,与牛、人和鼠的氨基酸序列同源性分别为97％、76％和74％.实时荧光定量PCR分析结果表明:奶山羊GPR41基因在小肠组织中表达量最高,其次是乳腺组织,在心脏和肾脏中表达量极低.试验结果表明GPR41可能在小肠和乳腺组织中发挥着重要的生理作用.     

必需氨基酸上调乳腺腺泡中L型氨基酸转运载体1的表达

To investigate the effect of essential amino acids on LAT1 expression in lactation mammary gland, the lactation mammary acini were cultured and LAT1 and 4F2hc expression were detected by Western blotting. The results showed that essential amino acids upregulated LAT1 and 4F2hc expression significantly in lactation mammary acini of dairy cow. It revealed that LAT1 was the mainly amino acid transporter in lactation mammary gland. The expression of LAT1 and 4F2hc was induced by essential amino acids.     

Expression of recombinant feline serum amyloid A (SAA) protein.

Feline serum amyloid A (SAA) cDNA clone was isolated from a hepatic mRNA of a mixed-breed cat. The feline SAA cDNA clone contains 333 nucleotides and deduced amino acid sequence shows 87.4%, 73.9%, and 65.8% homology with dog, human and mouse SAA respectively. Relative to the human and mouse SAA proteins, an additional peptide of eight amino acids is specified in the feline cDNA clone. Recombinant feline SAA (rfSAA) was expressed at high levels using pGEX bacterial expression system. Cleavage from the fusion moiety, and purification using glutathione-sepharose yielded pure soluble form of rfSAA. Antibodies generated against rfSAA were specific for feline SAA and showed no cross-reactivity with human SAA. Furthermore, antibodies against human SAA did not react with feline SAA. These results indicate that antigenicity of feline SAA is totally different from human SAA.     

Molecular cloning of canine RCAS1 cDNA

Receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells (RCAS1) is a novel cancer cell-surface antigen, strongly expressed in invasive cancers. RCAS1 inhibited the in vitro growth of immunocytes, and induced apoptotic cell death. The cloning of canine RCAS1 cDNA was carried out and identified from the mammary gland tumor of a dog. A canine RCAS1 cDNA of 864 bp in length has an open reading frame of 642 bp nucleotides encoding a protein of 213 deduced amino acids. The predicted amino acid sequence of canine RCAS1 showed 96.2% and 96.7% homologies with those of human and mouse RCAS1 respectively. Canine RCAS1 has an N-terminal transmembrane segment and a coiled-coil structure in the C-terminal protein, which are highly conserved in mouse and human RCAS1.     

Changes in tissue composition associated with mammary gland growth during lactation in sows.

Twenty-four primiparous sows were used to determine the extent of mammary gland growth during lactation. Litter size was set to nine or 10 pigs immediately after birth. Sows were slaughtered in groups representing d 0 (within 12 h after farrowing), 5, 10, 14, 21, and 28 of lactation. Sows were provided 17.5 Mcal ME and 65 g of lysine per day during lactation. Mammary glands were collected at slaughter and trimmed of skin and extraneous fat pad. Each gland was weighed, cut in half to measure cross-sectional area, and ground for chemical analysis. Dry matter content, dry fat-free tissue (DFFT) content, protein content, amino acids composition, ash content, and DNA content were measured. Only glands known to have been suckled were included in these data. Wet and dry tissue weight; cross-sectional area; and the amount of DFFT, tissue protein, and amino acids in each suckled mammary gland increased (P < .05) during lactation to a peak on d 21. Fat percentage of each suckled gland declined (P < .05) and the percentage of protein and DFFT increased (P < .05) as lactation progressed. These results suggest that hypertrophy occurred in the tissue during lactation. There was a linear increase in the amount and percentage of DNA during lactation (P < .05), suggesting hyperplasia of the mammary tissue. Mammary tissue growth continues in suckled glands during lactation in sows, with gland wet weight increased by 55% and total gland DNA increased by 100% between d 5 and 21 of lactation.     

减毒沙门菌介导防御素-3乳腺表达及对乳腺炎主要病原菌的抗菌效果

探讨减毒沙门菌介导的人HNP-3原前肽和前肽基因乳腺表达及其表达产物对牛乳腺炎主要病原菌的抗菌效果。构建人HNP-3原前肽和前肽基因的乳腺表达载体pEGFP-WAP-prepro-HNP-3和pEGFP-WAP-pro-HNP-3,电转化导入减毒沙门菌ΔcrpC78-1,构建重组菌ΔcrpC78-1（pEGFP-WAP-prepro-HNP-3）和ΔcrpC78-1（pEGFPWAP-pro-HNP-3）,重组菌分点注射到怀孕后20~22d母兔腹部乳腺分布区,收集兔分娩后不同时间的泌乳,Western-blot和荧光检测乳中HNP-3融合蛋白表达情况,ELISA检测乳中HNP-3融合蛋白的表达水平,常规方法分离乳腺炎主要病原菌,活菌计数法检测泌乳中HNP-3融合蛋白抑菌效果。结果显示,乳汁中分别在40 000和35 000处有prepro-HNP-3和pro-HNP-3融合蛋白阳性杂交信号,且在488nm处有黄绿色荧光;母兔在分娩后第5dHNP-3融合蛋白表达量最高,分别可达584μg/L和470μg/L,及至第25天表达量仍可达到277μg/L和213μg/L。活菌计数法结果表明分娩后第5d含prepro-HNP-3融合蛋白兔乳对牛乳腺炎主要病原菌大肠埃希菌、溶血巴氏杆菌、无乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的抑菌率分别为92.0%、54.8%、46.4%、48.8%、86.9%和74.9%;含pro-HNP-3融合蛋白乳的抑菌率分别为84.9%、46.5%、40.6%、40.4%、71.1%和58.4%。结果表明,减毒沙门菌能够介导人HNP-3融合蛋白基因在乳腺上皮细胞中定位表达,表达的preproHNP-3和pro-HNP-3具有较强的生物学活性,对牛乳腺炎主要病原菌具有明显的抑制作用,为乳腺炎的生物防控及生物源性抗菌肽的研究提供了参考。     

干扰PTEN基因对奶山羊乳腺上皮细胞脂质合成相关基因的转录及脂肪酸组成的影响

旨在通过RNA干扰技术揭示蛋白酪氨酸磷酸酶（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10，PTEN）基因在奶山羊乳腺上皮细胞中对乳脂合成及脂肪酸组成的影响。利用RT-PCR方法扩增到西农萨能奶山羊乳腺组织中PTEN基因（GenBank登录号：MK158074.1）的CDS区，进行序列分析和不同泌乳时期差异转录分析。合成靶向该基因的siRNA，由RT-qPCR结果筛选出有效siRNA，将其转染至奶山羊的乳腺上皮细胞，进一步检测干扰该基因后对脂质合成相关基因转录水平及脂肪酸组成的影响。结果表明：本研究首次克隆到奶山羊（Capra hircus）PTEN基因的CDS区，全长为1 212 bp；经序列比对发现，山羊的PTEN基因核苷酸序列同牛（Bos taurus）、猪（Sus scrofa）和人（Homo sapiens）的相似度分别为99%、98%和97%，编码氨基酸序列相似性均在99%以上；蛋白质结构预测发现：其蛋白不存在跨膜结构域，亚细胞定位于细胞质中，N端具有保守的磷酸酶功能区；该基因在奶山羊泌乳盛期乳腺组织中的转录量较干奶期下降51.5%；合成的siRNA转染至乳腺上皮细胞后，成功筛选出理想的siRNA，干扰效率达到94%（P<0.01）；与对照组相比，干扰PTEN基因后显著上调SREBP1、FASN、ACACA、SCD1基因转录量（P<0.01或P<0.05），显著下调LPL、FABP3、ACOX1、CPT1B、GPAM、DGAT2和HSL基因转录量（P<0.01或P<0.05）。脂肪酸检测分析发现：干扰该基因能够显著上调C16：1的去饱和指数（P<0.05），但对C18：1的去饱和指数没有显著影响。综上所述，PTEN基因能够调控乳腺上皮细胞中脂质合成相关基因的转录及脂肪酸组成，在奶山羊乳脂代谢中发挥重要作用。