奶山羊CIDEa基因的克隆、序列分析与组织表达

为获得奶山羊CIDEa基因序列并检测其在乳腺组织中的表达,采用RT-PCR技术从奶山羊乳腺组织扩增CIDEa基因序列,利用生物信息学软件对其进行预测分析,并采用荧光定量PCR检测CIDEa在干奶期和不同泌乳时期乳腺组织中的表达。结果表明:通过克隆测序得到奶山羊CIDEa基因CDS区660 bp,编码219个氨基酸,与GenBank公布的绵羊、牛、人和猪的核苷酸序列同源性分别为99%、96%、85%、85%。奶山羊CIDEa蛋白属于碱性、不稳定亲水蛋白,不存在跨膜结构和信号肽;蛋白主要定位在细胞质、线粒体和细胞核。CIDEa蛋白结构主要由α螺旋、β折叠和不规则卷曲组成。奶山羊CIDEa在泌乳前期、盛期和中期乳腺组织中表达量均显著高于干奶期(P<0.05)。说明CIDEa可能参与奶山羊乳腺的泌乳过程,为进一步研究其在奶山羊乳腺组织中的功能及对乳品质的调控作用奠定基础。     

奶山羊USF1基因的克隆与组织表达分析

为了获得奶山羊(Capra hircus)USF1基因序列并分析其在不同泌乳时期乳腺组织中的表达规律,从奶山羊乳腺组织中克隆得到USF1基因序列(Gen Bank登录号:MF953285),CDS区序列933 bp,编码310个氨基酸。通过序列比对发现,山羊与牛(Bos taurus)、猪(Sus scrofa)和人(Homo sapiens)的USF1基因核苷酸和氨基酸序列相似性均较高,为94%以上。蛋白质结构预测发现,USF1蛋白质结构为典型的螺旋-环-螺旋结构;其蛋白不含跨膜结构域,亚细胞定位在细胞核内。实时荧光定量PCR分析表明,USF1基因在奶山羊泌乳前期、盛期和中期的乳腺组织中m RNA表达量均显著高于干奶期(P0.05)。因此,USF1可能参与奶山羊乳腺的泌乳过程。该研究可为进一步揭示USF1基因在奶山羊乳腺组织中的功能及对脂质代谢的调控作用提供基础资料。     

家畜育种学课程教学改革与实践

为了适应学校应用型本科人才培养的要求,提高学生的专业素养和专业知识应用能力,对家畜育种学课程传统的教学方法、教学手段和教学内容等进行改革,探索适合应用型人才培养的教学方法和模式,从而激发学生的学习兴趣,提高课堂教学效果和学生的实践能力,以期为学生毕业后从事本行业工作打下坚实的专业基础。     

多种因素对小鼠卵母细胞体外受精效果影响的分析

为了探讨不同精子获能时间,精卵孵育时间,精子密度以及颗粒细胞对小鼠卵母细胞体外受精的影响,从而达到对卵母细胞体外受精体系优化的目的。比较了精子获能时间分别为40 min、60 min、80 min试验组的受精卵卵裂率。结果表明,带颗粒细胞卵母细胞(COCs)在三个试验组中卵裂率无显著差异,不带颗粒细胞卵母细胞(NO)在精子获能时间为60 min时卵裂率最高;比较了精卵孵育时间分别为2 h、4 h、6 h、8 h试验组的受精卵卵裂率,结果显示COCs精卵孵育时间2 h试验组的效果最好,NO孵育时间为6 h试验组的效果最好;比较了精子密度分别为3×10⁵/mL,3×10⁶/mL,3×10⁷/mL试验组受精卵卵裂率,结果显示COCs和NO均为3×10⁶/mL试验组卵裂效果最好;比较COCs和NO的受精卵卵裂率,结果显示COCs与NO之间存在显著差异(P<0.05),裸卵卵裂效果显著优于颗粒细胞卵裂效果。试验结果表明,在卵母细胞体外受精过程中,精子获能时间60 min,精子密度为3×10⁶/mL,精卵孵育6 h,培养24 h后卵裂率最高。     

多种激素对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

为了探讨促卵泡素(FSH)、人绒毛膜促性膜激素(HCG)、雌二醇(E_2)三种激素和丙酮酸钠在卵母细胞体外成熟培养液中的最佳添加浓度,深入研究小鼠卵母细胞体外成熟的规律,进而完善小鼠卵母细胞体外成熟培养体系,试验对小鼠卵母细胞进行体外培养,在完全培养基中单独或组合添加FSH、HCG、E_2三种激素,并在此基础上添加不同浓度的丙酮酸钠,分别测定第一极体(PB1)排出率和自然裸卵细胞(NO)死亡率。结果表明:小鼠卵母细胞经体外培养14 h后,在完全培养基中只添加FSH,1 IU/mL FSH试验组的卵母细胞体外成熟率最高,PB1排出率为52.50%, NO死亡率为15.00%;在只添加HCG以及1 IU/mL FSH和HCG组合添加试验中, 1 IU/mL HCG试验组卵母细胞体外成熟率最高,PB1排出率分别为35.70%和53.83%,NO死亡率分别为67.50%和25.00%;在只添加E_2试验中,1μg/mL E_2试验组卵母细胞体外成熟率最高,PB1排出率为47.00%,NO死亡率为0;在添加1 IU/mL FSH、1 IU/mL HCG和1μg/mL E_2的条件下添加不同浓度的丙酮酸钠,0.04 mg/mL丙酮酸钠试验组卵母细胞体外成熟率最高,PB1排出率为75.80%,NO死亡率为11.37%。说明在完全培养基中添加1 IU/mL FSH、1 IU/mL HCG、1μg/mL E_2和0.04 mg/mL丙酮酸钠,对小鼠卵母细胞PB1排出的促进作用最好,对NO体外成熟培养效果最好。     

基于Tet-on系统的RFP基因表达载体构建及其功能验证

【目的】构建四环素诱导表达调控系统的表达载体,并对其功能进行验证。【方法】利用pTRE-tight和pdsred-Express2-N1构建带有红色荧光蛋白（red fluorescence protein,RFP）基因的载体pTRE-DSred,用其与另一载体pTet-on共转染293T细胞,并加入不同质量浓度(0,0.1,1,10 μg/mL)的强力霉素（doxycycline,DOX）诱导,以未经质粒转染的293T细胞为对照组,在荧光显微镜下观察RFP基因的表达情况。【结果】成功构建了pTRE-DSred重组质粒,将其与pTet-on质粒共转染293T细胞,在细胞培养液中分别添加0.1,1,10 μg/mL DOX,48 h后均有红色荧光蛋白的表达,但10 μg/mL DOX组红色荧光蛋白的表达水平明显低于前2个组;0 μg/mL DOX诱导组中也有红色荧光蛋白表达,但水平极低;在未转染质粒对照组中未观察到红色荧光蛋白的表达。RT-PCR结果显示,pTRE-Dsred和pTet-on共转染组均检测到RFP基因的转录。【结论】成功构建了Tet-on系统RFP基因表达载体,适宜质量浓度的DOX诱导有助于目的基因的高水平表达,但在不添加DOX诱导剂时,该Tet-on系统存在目的基因低渗漏表达现象。     

奶山羊ATGL基因启动子鉴定与转录活性分析

脂肪甘油三酯水解酶(ATGL)是脂肪水解过程中的主要限速酶，是调控细胞中甘油三酯和脂肪酸之间平衡的关键因子。为了分析奶山羊ATGL基因启动子的结构及转录调控机制，以奶山羊全血DNA为模板，通过PCR技术扩增出ATGL基因5′侧翼序列并进行生物信息学分析；构建了5个不同长度的启动子缺失片段报告基因载体，通过转染奶山羊乳腺上皮细胞并检测其活性，确定其核心区域；分别用PPARG激动剂罗格列酮和SREBP1激动剂T0901317处理细胞，检测其对ATGL启动子活性的影响。结果表明，克隆得到奶山羊ATGL基因5′侧翼序列2 721 bp,包含转录起始位点上游2 024 bp。经在线软件分析发现，ATGL启动子含有真核生物启动子元件TATA-box和CpG岛；对转录因子结合位点预测发现，其上含有FOXO、SREBF1、PPARG、C/EBPα和E2F1等结合位点。启动子活性分析结果表明，ATGL启动子核心区域位于转录起始位点上游-256—+1位，且在-527—-256位存在负调控元件。用罗格列酮和T0901317处理细胞后发现，二者均能显著上调ATGL启动子活性，且罗格列酮作用的区域为-527—-...