动物产品的DNA提取方法

采用以异硫氰酸胍法为基础的提取方法分别提取牛肉、山羊肉、鸡肉、猪肉干、鱼粉、牛奶粉、牛奶、鱼油以及牛油中的DNA,18S rDNA片段的PCR扩增结果表明各样品已提取到DNA,且DNA中不含抑制PCR的物质。牛肉、牛奶粉、牛奶、加入牛肉DNA的鱼油和牛油的牛源性成分PCR检测结果为阳性;山羊肉和加入山羊肉DNA的鱼油的羊源性成分PCR检测结果为阳性;牛、羊源性成分PCR产物经酶切鉴定为非假阳性。这些结果显示本研究建立的动物产品DNA提取方法是可行的。     

动物产品中牛、羊源性成分多重PCR检测方法的建立

以肉骨粉、鱼粉、猪肉干和鱼肉干为研究对象,异硫氰酸胍法提取总DNA,18S rDNA片段的扩增结果表明提取到的DNA中不存在抑制PCR的物质。应用梯度PCR技术对牛、羊源性成分检测的退火温度进行了优化,在单一PCR检测技术的基础上分别进行了18S rDNA片段和牛、羊源性成分的多重PCR分析,得到了预期的结果。试验表明,本文建立的多重PCR方法具有快速、简便、准确等特点,对动物产品牛、羊源性成分检测具有重要意义。     

饲料与动物产品中牛、羊源性成分的多重PCR检测

以鱼粉、奶粉、牛奶、果乳、鱼油及牛油为试验材料,进行了18S rDNA片段、牛源性成分和羊源性成分之间的多重PCR检测。多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全一致。结果表明,多重PCR方法用于进出口饲料及动物产品中牛、羊源性成分的同时检测是可行的。     

实时荧光PCR法检测饲料中牛、羊源性成分

为了快速准确地检测饲料中牛、羊源性成分,试验采用实时荧光PCR方法,分别以牛、羊各自物种特异性基因为研究对象,设计实时荧光PCR扩增的特异性引物及探针,建立饲料中牛、羊源性成分的实时荧光PCR检测方法。结果表明:该检测方法特异性强、灵敏度高(达到0. 01%),可以作为饲料中牛、羊源性成分检测的常规方法。通过对15种市售饲料样品进行检验,结果 2种饲料骨粉未标明含有羊源性成分,但检出;1种饲料骨粉标签中未标明成分,但检出牛源性成分,证实该方法操作简便快捷,可以快速、准确、大批量地开展饲料的日常检测工作。     

饲料中牛羊源性成分的定性检测——定性聚合酶链式反应法(PCR)法

目的:为防止疯牛病和痒病的传播。方法:研究提供了一种利用从动物饲料中提取牛羊动物基因组DNA的方法,并依据牛、羊基因组DNA的特异性序列片段,利用种属特异性的引物,通过PCR扩增这一特定的DNA序列,通过电泳分离PCR产物,以长度的PCR产物作对照。结论:实现了对动物饲料中牛、羊源成分的检测。     

动物产品及饲料中牛源和羊源性成分PCR检测方法的优化

以牛肉、山羊肉为试验材料，对动物产品及饲料中牛源、羊源性成分PCR检测方法进行了优化。结果，牛源性成分的最低检测限可达10μg/g，羊源性成分的最低检测限达0．1μg/g。PCR检测和酶切鉴定结果表明，在水平测试的混合饲料粉中可检出牛源、羊源性成分。     

饲料中牛、羊源性成分现场可视化检测方法的建立

根据牛、羊线粒体中物种特异性序列设计引物,应用可视化环状等温扩增技术（visual loop-mediate isothermal amplification,vLAMP）对牛、羊源性成分进行快速扩增及可视化判断,同时建立牛、羊源成分人工污染的饲料模型,考察vLAMP检测方法的灵敏度。结果表明,牛源性引物和羊源性引物仅分别对牛、羊源性成分产生特异性扩增,灵敏度高达0.001%。本试验所建立的牛、羊源性成分现场可视化筛查方法具有较高的特异性与灵敏度,操作简单、快速,可用于饲料中牛、羊源性成分污染和食品掺伪的现场可视化检测。     

2种PCR方法检测饲料中牛和羊源性成分灵敏度

疯牛病自发生以来已给全球畜牧业带来了巨大的损失,已成为一种严重危害人类生命安全的传染病.因此,建立起有效的饲料中牛和羊源性成分的检测方法,避免带病毒的动物和饲料在市场上和国际间流通显得刻不容缓.目前,我国主要采用PCR方法进行饲料中牛和羊源性成分的检测.文章拟对普通PCR和Realtime PCR 2种方法的灵敏度进行比较,希望寻找出一种有效和灵敏度更高的方法,为实际的检测工作提供依据.     

应用线粒体DNA鉴定动物源性饲料成分研究进展

为避免牛海绵状脑病和羊痒病疫区的蛋白饲料进口造成畜牧业上的经济损失,世界各国纷纷开展用分子生物学方法检测牛、羊源性蛋白饲料,本文就运用分子生物学方法有效检测动物物种间线粒体DNA特异性以确认动物源性蛋白饲料成分的来源作出阐述。     

浅析饲料中牛、羊源性成分的检测技术

流行病学调查证明，用患有疯牛病和羊痒病的牛、羊等动物的肉和骨头制成的肉骨粉喂养动物会导致疯牛病和羊痒病的传播，是引起疯牛病发生的最初原因。目前，用于检测饲料中牛、羊源性成分的主要方法有：以检测骨头为基础的显微镜方法；以检测蛋白质为基础的免疫学方法和以检测DNA为基础的检测方法；其它方法还包括近红外光谱法等。     

绵羊血液中布氏杆菌DNA提取方法的比较研究

本研究旨在比较5种DNA提取方法对绵羊血液中布氏杆菌DNA的提取效果及对PCR检测的影响。将不同浓度的疫苗株布氏杆菌加入绵羊全血中,采用3种DNA提取试剂盒和酚/氯仿法以及碘化钠法等5种方法提取模拟的绵羊血液样品中的DNA,评价所获得DNA的浓度、纯度和完整性,并采用布氏杆菌特异性PCR进行检测。同时,对各提取方法所需时间及经济成本进行了比较。结果表明,各方法均能提取获得绵羊全血中布氏杆菌DNA,3种试剂盒和碘化钠法获取布氏杆菌DNA的效果相同,而酚/氯仿法获取布氏杆菌DNA的效率最低或存在PCR抑制剂而不适合用于绵羊血液中布氏杆菌的PCR检测。碘化钠法具有耗时较短、成本低、方便的优点,是从绵羊血液中提取布氏杆菌DNA的良好方法。本研究结果为临床绵羊血液中布氏杆菌DNA提取方法的选择提供了参考。     

用分子生物学方法鉴别检测动物源性饲料中的牛羊源性成分

为了防止海绵状脑病疫区和痒病疫区反刍动物源性饲料进入我国 ,非常有必要对贸易往来中的肉骨粉品种来源进行鉴定检测。我们采用分子生物学方法从动物源性饲料中鉴别检测牛、羊特异性线粒体DNA的片段 ,并用限制性内切酶SspⅠ对PCR产物进行酶切鉴定及DNA序列测定。该方法的灵敏度可达 0 .12 5 % ,具有灵敏度高、快速和特异性强的优点。     

六种试剂盒提取血液基因组DNA效果比较

为筛选一种高效、快捷的血液基因组DNA提取试剂盒,采集24份新鲜西藏绵羊血液样本,选用6种市售商业化试剂盒（LifeFeng柱式试剂盒DK601和非柱式试剂盒DK602,康为世纪非柱式试剂盒CW0544和柱式试剂盒CW0546,上海生工非柱式试剂盒SK8224和柱式试剂盒SK8254）,比较所提DNA的浓度、纯度、得率以及对嗜吞噬细胞无形体16S rRNA进行巢式PCR扩增,综合评价不同试剂盒DNA提取效果.结果表明,应用LifeFeng柱式试剂盒DK601提取的DNA浓度和纯度均最高,得率较高,分别达到75.63 ng/μL、1.894（OD260/OD280）、18.91 ng/μL;且嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因的PCR扩增条带清晰度最优.因此,LifeFeng DK601可作为提取绵羊血液基因组DNA及嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum）病原鉴定的首选试剂盒.     

感染细胞与痘疹样本中山羊痘病毒PCR检测方法的建立

比较Trizol法和SDS-蛋白酶K法提取山羊痘病毒DNA后,根据山羊痘病毒P32基因设计引物,建立了能检测感染细胞培养物与组织病料的PCR方法,结果显示以SDS-蛋白酶K法提取的病毒DNA在含量与纯度上均明显高于Trizol法;该PCR方法对山羊痘标准毒株细胞感染物能扩增出特异性的DNA条带,最小检出量为40.625ng;且能检出山羊痘疫苗毒Y株、贵州现场分离毒LD株和QL株的细胞感染物以及山羊痘疹样本中病毒DNA,而对鸡痘疫苗毒株感染细胞、正常细胞及正常山羊皮肤均为阴性反应。这些结果表明,建立的PCR方法具有特异性强、可靠性好、灵敏度高等特点,可用于山羊痘的临床诊断。     

羊肉产品中若干动物源性成分的七重PCR检测技术应用研究

试验建立了猪、牛、绵羊、山羊、鸡、马和牦牛种属鉴别的七重PCR体系,分析了牛、牦牛、山羊源性成分七重PCR检测的灵敏度,检测了10种市售羊肉产品中的动物源性成分。结果表明,采用常规的琼脂糖凝胶电泳可以区分157～517 bp的片段及相互差异在41 bp以上的多重PCR扩增产物,从而实现对这7个物种的快速及准确鉴别,其中对3个物种(牛、牦牛、山羊)DNA的检测灵敏度在2.5 ng左右;所检测的10种羊肉产品中有2种并不是包装上所宣称的羊肉,而是混杂有牛肉或完全用牛肉替代。     

羊痘病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立

为建立羊痘病毒(CaPV)的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,本研究根据GenBank中羊痘病毒的保守基因序列,设计出针对羊痘病毒的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪优化得到病毒核酸等温扩增最佳条件是62 ℃恒温反应60 min。在此条件下,病毒核酸的最低检测含量为3.1×10^-2 pg/μL,灵敏度比OIE推荐的PCR方法高10⁴倍。添加钙黄绿素(calcein)建立的目测法,还可实现对上述病原体检测结果肉眼观察。本研究获得的CaPV LAMP仪器法和目测法可特异性地扩增羊痘病毒属的山羊痘病毒、绵羊痘病毒及牛疙瘩皮肤病病毒核酸,具有反应快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、设备要求低等特点。     

根据线粒体保守序列检测鹿属动物源性成分

本文根据鹿线粒体mtDNA细胞色素b中的保守序列 ,设计了针对鹿属动物的特异性扩增引物。通过聚合酶链反应 (PolymeraseChainReac tion,PCR)得到 1 94bp的特异片段 ,而其它动物如鸡、牛、羊、兔、猪、鱼、骆驼、马等中则无此条带。通过内切酶AlwI酶切可对扩增结果进行验证。该方法对鹿成分的检测低限为 0 1 % ,可作为饲料中鹿属动物源性成分鉴别检测的有效方法之一 ,也可作为鹿类药材真伪鉴别的方法。     

Identification of Corynebacterium pseudotuberculosis isolates from sheep and goats by PCR

The present study was carried out to estimate the prevalence of caseous lymphadenitis (CL) in sheep and goats slaughtered at the local abattoir in Elazig province located in the east of Turkey, between September and December 2000. A total of 2046 sheep and 2262 goat carcasses were examined during the study period and 118 abscessed lymph nodes, 89 from sheep and 29 from goats, were collected. Corynebacterium spp. strains were isolated from 81.4% of the abscesses, giving an overall prevalence of 2.2%. The prevalence was 3.5 and 1.1% in sheep and goats, respectively. PCR on DNA extracted from 96 suspicious isolates, using a pair of Corynebacterium pseudotuberculosis-specific primers, was positive for 93. Although cross-reaction with C. ulcerans, a human/bovine species, was observed, the PCR assay used in this study may successfully be applied for the diagnosis of CL in goats and sheep as an alternative to conventional methods, owing to its advantages of specificity and speed.     

运用SYBR Green Ⅰ熔解曲线法检测饲料中牛、羊源性成分的研究

试验旨在建立SYBR Green Ⅰ熔解曲线法对饲料中牛、羊源成分进行检测,以SYBR GreenⅠ为荧光染料,通过优化PCR反应体系,提高了检测灵敏度。在随机抽检的145批样品中,与国标法（GB/T20190-2006）相比,SYBR GreenⅠ熔解曲线法的准确性达到了100%,此方法可作为饲料中牛羊源成分检测的一种方法。