利用酵母双杂交筛选与苹果褪绿叶斑病毒CP互作的寄主因子

【目的】利用酵母双杂交系统筛选与苹果褪绿叶斑病毒（Apple chlorotic leaf spot virus, ACLSV）外壳蛋白（coat protein, CP）互作的寄主因子,利用生物信息学方法分析其在病毒与寄主互作过程中可能发挥的作用。【方法】首先构建ACLSV CP的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP,转化至酵母菌株Y2H gold中,测定转化菌在SD/-Trp、SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade-X-α-Gal平板上的生长情况,从而判断其在酵母双杂交过程中对报告基因的自激活活性。将pGBKT7-CP及pGBKT7分别转化至酵母菌株Y2H gold,培养不同时间后,用紫外分光光度计测定OD₆₀₀值,分析pGBKT7-CP对酵母菌生长的影响;然后通过顺序转化的方法自前期已构建好的苏俄苹果（Malus sylvestris cv. R12740-7A）cDNA文库中钓取与ACLSV CP互作的因子,最终在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上筛选生长良好的蓝色阳性菌落,测定序列,并在GenBank中对其进行BLAST分析,根据基因注释推断其在病毒与寄主互作过程中可能发挥的作用。【结果】成功构建了酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-CP,转化至酵母菌株Y2H gold后,转化菌只能在SD/-Trp平板上正常生长,不能在SD/-Trp/-His和SD/-Trp/-Ade-X-α-Gal平板上生长,表明重组质粒自身不能激活报告基因His及Ade的表达,没有自激活活性。酵母双杂诱饵载体pGBKT7-CP与对照空质粒转化菌生长情况相似,证明诱饵载体对酵母菌没有毒性;筛选到了69个互作寄主基因,包括转录因子活性、碳固定活性、细胞内铁离子平衡、防御反应、水解酶活性、氧化酶活性、氧化还原酶活性、光系统II组件、绑定蛋白等10类蛋白,经生物信息学分析,其中8个寄主基因（Malus3-1、Malus4-2、Malus4q1、Malus31-3、Malus49q2、Malus15-1、Malus6-2、Malus91-4）可能在病毒与寄主互作过程中起重要作用。【结论】分析筛选到的重要寄主蛋白功能,推测ACLSV CP与BZIP类、MYB类转录因子、病程相关蛋白（PR-5、PR-8、PR-10）互作,可能调控了寄主对病毒的抗性作用;与光系统II（PSII）的稳定性/装配因子蛋白、铁结合蛋白互作,影响植物光系统的稳定性及叶绿素的形成,从而降低光合作用。这将为揭示ACLSV导致寄主产生褪绿叶斑及树体衰退的原因提供理论依据。     

IHHNV编码蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活研究

应用酵母双杂交体系,构建凡纳滨对虾IHHNV 3个开放阅读框的酵母双杂交诱饵载体,并对该载体的表达产物对酵母细胞的毒性及其对报告基因的自激活作用进行检测,为运用酵母双杂交文库筛选与病毒互相作用的蛋白提供参考。对凡纳滨对虾IHHNV病毒3个开放阅读框的基因片段进行PCR特异性扩增,并运用In-Fusion技术将该基因片段与双酶切的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7进行连接,获得重组质粒pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2,并进行自激活和毒性检测。结果表明,pGBKT7-CP、pGBKT7-NS1和pGBKT7-NS2等3个重组质粒对MEL1报告基因无自激活性;对AUR1-C报告基因无自激活作用,pGBKT7-CP,pGBKT7-NS1,pGBKT7-NS2和空载体的酵母菌在SD/-Trp液体培养基中培养16 h后,菌液的OD_(600)均大于0.8,说明诱饵载体无毒性且不具自主激活报告基因的功能,所获得的无自激活作用的诱饵载体可用于酵母双杂交试验。     

同源重组快速构建甘蓝SCR 酵母双杂交诱饵载体及其自激活作用的检测

采用巢式PCR获得甘蓝SCR的成熟肽编码区,利用同源重组技术首次将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交系统的诱饵载体pGBKT7-SCR,结果表明:通过巢式PCR获得了正确的甘蓝SCR成熟肽编码区,并成功构建到pGBKT7诱饵载体中,且转化有诱饵载体的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,而在SD/-His-Trp和SD/-Trp/X-a-Gal/AbA营养缺陷平板上皆不能生长,说明对报告基因无自激活作用;且毒性实验也表明,SCR蛋白对酵母没有毒害作用.     

小麦h型硫氧还蛋白Trx-h酵母双杂交诱饵载体的构建和自激活检测

为构建小麦h型硫氧还蛋白Trx-h酵母双杂交诱饵载体,并检测其对酵母细胞的自激活作用.利用RT-PCR扩增Ta Trx-h基因的ORF区域,并与pGBKT7载体连接构建诱饵载体pGBKT7-Trx-h,利用PEG/LiAC法转化酵母AH109后,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无自激活作用.结果表明,含pGBKT7-Trx-h质粒的酵母在SD/-Trp-Leu培养基上能正常生长,说明诱饵载体表达产物对酵母细胞无毒性作用;在SD/-Trp-Leu-His-Ade培养基上不能生长,说明诱饵质粒无自主激活报告基因的作用.因此,可以利用该诱饵载体通过酵母双杂交方法筛选与Trx-h蛋白相互作用的蛋白.     

水稻LRR型受体蛋白激酶OsRPK1胞外区酵母双杂交诱饵载体构建

[目的]寻找水稻LRR型蛋白受体激酶(Leucine rich repeat receptor protein kinase) OsRPK1胞外结构域的互作蛋白.[方法]以日本晴水稻为研究材料,以水稻根部cDNA为模板通过PCR扩增方法得到OsRPK1胞外结构域基因编码片段OsRPK1-OD(969 bp).将该片段插入酵母双杂交诱饵载体pGBKT7,构建重组诱饵载体pGBKT7-OsRPK1-OD.[结果]对pGBKT7-OsRPK1-OD进行毒性检测和转录自激活鉴定,酵母生长结果发现,含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold细胞,在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-gal营养缺陷型固体培养基上生长出白色菌落,在SD/-Trp/X-α-gal/AbA固体培养基上生长受到抑制;在SD/-Trp生长出含有pGBKT7-OsRPK1-OD载体的Y2H Gold酵母菌落大小与转化了空载的酵母菌落大小一致,显示插入的OsRPK1-OD对酵母生长无毒性作用.[结论]OsRPK1-OD无法参与激活转录酵母中报告基因HIS3,ADE2,MEL1和AUR1-C,该片段可以作为诱饵基因筛查水稻cDNA文库,寻找与之相互作用的蛋白质.     

新城疫病毒V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒的构建与鉴定

为构建新城疫病毒(NDV)V蛋白C端酵母双杂交诱饵质粒,用RNA试剂盒提取NDV F48E9株的RNA,通过反转录试剂盒将抽提的RNA反转录,以反转录合成的eDNA为模板,通过PCR扩增,获得V蛋白C端基因(VCTD).通过酶切连接的方法将V蛋白C端基因克隆至pGBKT7载体上,命名为pGBKT7-VCTD.将pGBKT7-VCTD转化酵母Y2H Gold酵母感受态细胞,转化产物涂布营养缺陷型平板,观察平板上菌落生长情况,判定诱饵质粒有无自激活能力:同时挑取平板上的生长的菌落接种液体培养基培养,绘制生长曲线,判定pGBKT7-VCTD诱饵质粒有无毒性.酶切和测序结果表明,成功构建pGBKT7-VCTD诱饵质粒,且该诱饵质粒在酵母细胞中无毒性和自激活能力.本研究成功构建了pGBKT7-VCTD诱饵质粒,为筛选NDVV蛋白C端纳米抗体奠定基础.     

小麦TaDREB6转录因子互作蛋白的筛选

 【目的】利用酵母双杂交技术从小麦cDNA文库中筛选TaDREB6互作蛋白,进一步研究DREB介导的小麦抗逆机制。【方法】以小麦的cDNA为模板扩增得到TaDREB6,构建小麦cDNA文库和pGBKT7-TaDREB6诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaDREB6以及pGADT7和cDNA文库混匀转入AH109酵母感受态细胞,在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp营养缺陷型培养基上,30℃培养3—5 d,挑取平板上直径大于2 mm的菌落,进行显蓝筛选。【结果】对筛选到的102个候选阳性克隆进行测序,在NCBI上进行BLAST比对分析,获得与能量代谢、抗逆和防御、转运、转录和翻译、信号转导以及生长发育等相关的候选蛋白。【结论】筛选得到候选蛋白的功能预测表明TaDREB6可能参与了多条信号转导途径,在抗逆境调控中具有重要作用。     

猪传染性胃肠炎病毒 M 基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

筛选与猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)M蛋白相互作用的宿主蛋白,构建M蛋白的诱饵载体pGBKT7-M.首先利用PCR技术从重组表达载体pFastBacTM-M中扩增得到M基因,定向克隆至载体pMD19-T simple,验证正确后克隆至酵母双杂交系统诱饵表达载体pGBKT7,经双酶切、PCR反应及测序验证其正确插入后,利用PEG/LiAc法将构建好的重组诱饵载体pGBKT7-M及空载体pGBKT7分别转化到酵母Y2HGold感受态细胞中,检测其对酵母菌株是否有毒性作用和自激活活性及诱饵蛋白在酵母细胞内的表达情况.结果表明:扩增得到M基因738bp,成功构建了诱饵表达载体pGBKT7-M,此诱饵载体对酵母细胞无细胞毒性和自激活活性.Western blot检测到5×104左右的蛋白条带,显示诱饵蛋白在酵母细胞内稳定表达.     

PnsICE1基因酵母双杂交诱饵载体构建及转录自激活检测

为了更好地研究与Pns ICE1基因互作的蛋白,利用PCR方法扩增含有p GBKT7载体同源序列的Pns ICE1基因片段,构建酵母双杂交载体。测序结果表明,构建的目标基因序列正确。将诱饵载体质粒转化酵母菌株Y2H感受态细胞,Pns ICE1转化菌在SD/-Trp营养缺陷型培养基中正常生长,在SD/-Trp/X-a-Gal筛选培养基上长出蓝色的酵母单菌落,说明Pns ICE1转录因子具有转录自激活活性。     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和运动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白（Coat Protein CP）和移动蛋白（Movement Protein MP）基因序列合成了CP、MP基因的上下游引物。通过PCR扩增获得含有目的基因的片段，经过SalⅠ和PstⅠ双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序，构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP，用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白，为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子、克隆寄主因子、推测其种类和功能奠定了基础。     

拟南芥AtGRP7基因诱饵载体的构建及酵母双杂的初筛

AtCRPI基因是拟南芥的一个从动振荡器基因,目前其生理功能知之甚少。为了更好地研究与AtCRP7基因的互作蛋白,笔者利用PCR技术从携带AtGRP7基因序列的质粒中扩增该基因的编码序列,然后将目标序列插入pGBKT7载体的NcoⅠ和PstⅠ2个酶切位点之间,构成酵母双杂体系的诱饵载体。酶切和测序结果表明,构建的载体目标基因序列和阅读框是正确的。之后,将该载体转入感受态酵母Y2HGold菌株中,并检测其表达物对报告基因的激活情况。AtGRP7酵母转化菌在SD／-Tip平板上长势良好;在SD／-Trp-Ade平板上长势较弱;在SD／-Trp／-His和SD／-Trp／-Ade／-His平板上则没有生长。这说明His合成相关基因没有被转录和翻译,AtGRP7基因在该酵母双杂体系中没有自转录激活。笔者在酵母双杂的初步筛选中,还获得几个可能与AtGRP7互作的基因。     

猪I型补体受体与C3b活性片段相互结合的体外检测

【目的】检测猪红细胞类补体受体I型（Complement receptor 1-like,CR1-like）与C3b活性片段能否发生结合,以期为阐明猪红细胞发挥免疫粘附功能的分子机理提供科学数据。【方法】利用前期已构建的CR1-like_(3-6)、CR1-like_(8-11)功能域片段的重组质粒建立酵母双杂交检测体系,运用酵母共转化的方法将诱饵质粒（重组pGBKT7-CR1-like）与捕获质粒（重组pGADT7-C3b）共同转入Y2HGold酵母细胞中,分别利用一缺平板SD/-Leu、SD/-Trp和二缺平板SD/-Leu/-Trp（DDO）严格筛选共转化成功的酵母细胞,再根据报告因子是否表达来鉴别转化子在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal（DDO/X）、SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal/Aba（DDO/X/A）二缺培养板上的生长情况,并结合菌落的颜色变化现象综合判定CR1-like活性片段与补体C3b在酵母细胞中是否发生相互结合;然后运用免疫沉淀技术分离酵母细胞中CR1-like与C3b结合复合物,并对该复合物的特异性进行Western blot鉴定。【结果】试验成功将pGBKT7-CR1-like与pGADT7-C3b基因共转入Y2HGold酵母细胞。共转化的酵母克隆在SD/-Leu、SD/-Trp、DDO平板上能够正常生长,在DDO/X、DDO/X/A平板上正常生长且菌落呈现蓝色,由此表明,试验中酵母双杂交系统建立成功,并通过试验获得了阳性酵母克隆。共同转化了pGBKT7-CR1-like和pGADT7-C3b质粒的酵母菌落PCR反向鉴定结果显示,在共转化的酵母菌中含有目的基因CR1-like_(3-6)和CR1-like_(8-11),共转化组的质粒酶切后出现C3b基因片段,与设计大小一致,说明重组质粒成功共转化入酵母细胞中。免疫沉淀试验中应用pGBKT7载体的标签抗体c-Myc沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以c-Myc为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)的融合蛋白在50 kD处出现特异性条带;共转化pGBKT7-CR1-like_(3-6) + pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like_(8-11) + pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带;以HA单克隆抗体为一抗进行Western blot检测时,在pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,只有3、4泳道中共转化的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在CR1-like与C3b识别结合的复合物。使用CR1-like单克隆抗体沉淀酵母细胞中的融合蛋白,以CR1-like单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,单独转化了pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)的融合蛋白在50 kD处出现特异性条带;共转化pGBKT7-CR1-like_(3-6) + pGADT7-C3b和共转化pGBKT7-CR1-like_(8-11) + pGADT7-C3b的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带;以C3单克隆抗体为一抗进行Western blot检测发现,在pGBKT7-CR1-like_(3-6)和pGBKT7-CR1-like_(8-11)融合蛋白中没有出现特异性条带,泳道3、4所示只有共转化的酵母融合蛋白在83 kD处出现特异性条带,表明在Y2HGold酵母细胞中存在具有生物活性的CR1-like与C3b识别结合的复合物。通过多个单克隆抗体杂交结果,可看出诱饵质粒的表达产物CR1-like_(3-6)、CR1-like_(8-11)片段与捕获质粒的表达产物C3b片段可在酵母细胞内发生结合。【结论】猪红细胞CR1-like发挥免疫粘附功能的识别配体为C3b,为猪红细胞CR1-like功能域分子结构的进一步解析提供了重要数据依据。     

eSRKs酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用的检测

为研究甘蓝自交不亲和决定因子S位点富含半胱氨酸蛋白/S位点蛋白11(SCR/SP11)与S位点受体激酶(SRK)胞外域高变区(eSRKs)的相互作用,构建了eSRKs基因的酵母双杂交诱饵载体,检测其自激活作用,并验证是否适用于后续的相互作用研究.以甘蓝B3为材料,通过RT-PCR技术获得eSRKs目的基因片段,将其克隆到pGBKT7载体中,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-eSRKs;测序正确后,将重组质粒转入Y2HGold,检测其表达产物对酵母细胞有无毒性以及对报告基因有无自激活作用,结果获得了正确的eSRKs基因片段,并成功克隆到pGBKT7诱饵载体中,且转化在有诱饵载体pGBKT7-eSRKs的Y2HGold在SD/-Trp营养缺陷平板上生长良好,表明表达产物对酵母细胞无毒性;显色反应结果表明对报告基因也无自激活作用,为下一步利用酵母双杂交系统检测SCR蛋白与SRK蛋白胞外域高变区的相互作用奠定基础.     

大麦黄矮病毒外壳蛋白基因和移动蛋白基因酵母表达载体的构建

根据已知的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(Coat protein,CP)和移动蛋白(Movement protein,MP)基因序列合成了CP和MP基因的上下游引物,通过PCR扩增获得目的片段,经过Sal I和Pst I双酶切、连接、转化、重组质粒的酶切鉴定及基因测序,构建了酵母表达载体pGBKT7-GPV-CP和pGBKT7-GPV-MP,用于在酵母双杂交分析中表达诱饵融合蛋白,为进一步筛选小麦cDNA文库内与大麦黄矮病毒互作的寄主因子和克隆寄主因子,以及其种类和功能打下坚实的基础.     

水稻SGR酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

[目的]揭示SGR基因的作用机理。[方法]构建水稻SGR基因在酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其表达进行鉴定,将目的基因SGR与诱饵质粒载体pGBKT7通过双酶切定向重组构建诱饵质粒pGBKT7-SGR,将pGBKT7-SGR转入酵母菌株Y187中,利用Western印迹法检测其在酵母中的表达,通过缺陷性培养基培养进行自激活检测。[结果]将鉴定正确的重组质粒测序结果与SGR基因比较,序列完全一致,阅读框分析正确。载体pGBKT7-SGR在酵母菌株Y187中可以正确表达出融合蛋白。重组诱饵pGBKT7-SGR质粒对酵母无毒性,其表达产物不能激活酵母菌株Y187的营养缺陷型报告基因。[结论]该重组诱饵质粒可用于酵母双杂交体系,该研究为从cDNA文库筛选水稻诱饵蛋白SGR的互作蛋白奠定了基础。     

TcLr19PR1、TcLr19PR2和TaLr19TLP1的酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定

在前期研究的基础上,将成功克隆得到3个病程相关蛋白PR1、PR2和PR5的序列,分别命名为TcLr19PR1、TcLr19PR2和TaLr19TLP1。将这3个基因分别连接到酵母双杂交诱饵载体pGBKT-7上,并转化到感受态菌株Y2HGold中,检测其毒性和自激活性。结果显示,成功构建了包含目的基因的诱饵重组载体pGBKT-7-TcLr19PR1、pGBKT-7-TcLr19PR2和pGBKT-7-TaLr19TLP1;将转化产物涂布于SD/-Trp/X平板上,生长良好,并出现阳性克隆;毒性检测中,将3个诱饵重组载体与空载体在SD/-Trp液体培养基中的生长情况进行对比,发现诱饵无毒性;自激活检测试验中,重组载体无法在二缺、三缺和四缺培养基中正常生长,证明诱饵无自激活性。因此,本研究成功构建的3个诱饵重组载体可用于3个PR蛋白互作蛋白的筛选,为进一步研究其在小麦与叶锈菌互作中的分子机理奠定基础。     

酵母穿梭表达质粒pGBKT7-hCK2α＇的构建

目的：用人蛋白激酶CK2α’(hCK2α’)cDNA片段构建酵母双杂交体系中“诱饵”载体。方法；通过PCR扩增已构建成功的重组质粒pThCKA’获得人CK2α’亚基编码区cDNA，将PstⅠ／NdeⅠ双酶切的PCR产物连接到同样酶切的“诱饵”载体pGBKT7，转化感受态细胞DH5α获得转化子．琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化子，将阳性克隆进行限制性内切酶酶切与DNA测序的方法鉴定。将DNA测序验证的pGBKT7-hCK2α’转染感受态酵母株AH109．Westernblot签定hCK2α’蛋白表达．检测表达产物对报道基因的激活作用及对酵母株AH109的毒性。结果：限制性酶切结果表明，插入片段和重组质粒的大小与理论值推测值相符。重组质粒pGBKT7-hCK2α’转染的酵母株AH109中能够表达hCK2α’蛋白，pGBKT7-hCK2α’无自主激活报道基因的能力及对酵母的生长无毒性。结论：pGBKT7-hCK2α’酵母双杂“诱饵”载体构建获得成功，可应用于酵母双杂交体系。     

甘蓝OguCMS育性相关转录因子BoMYB1的转录激活功能分析

OguCMS是甘蓝中应用最为广泛的雄性不育类型,前期表达谱分析表明转录因子BoMYB1在OguCMS花药中表达下调达10.3倍。通过构建酵母双杂交转录因子BD区诱饵载体pGBKT7-BoMYB1,将其转入酵母菌AH109中进行转录因子BoMYB1转录激活功能的分析。结果显示,AH109[pGBKT7-BoMYB1]在SD/-Trp/x-a-gal、SD/-Ade/-Trp/x-a-gal、SD/-His/-Trp/x-a-gal平板上均长出蓝色菌落,表明BoMYB1可以自主激活报告基因ADE2、HIS3和MEL1,说明转录因子BoMYB1具有转录自激活功能。研究结果对于深入探索该基因的功能及阐明OguCMS花药败育的机理具有重要意义。     

水稻NBS-LRR类抗稻瘟病蛋白Pik-h的互作蛋白筛选

【目的】利用酵母双杂交系统,以组成抗稻瘟病基因Pik-h介导的抗病反应途径。【方法】以含抗稻瘟病基因Pik-h的近等基因系IRBL8为材料,取稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)GD0193接种12和24 h后的水稻叶片,等量混合后提取总RNA,按照2个紧密连锁且功能独立的Pikh-1和Pikh-2蛋白为诱饵,在水稻叶片中筛选与之互作的蛋白,以便深入研究抗病基因Pik-h的酵母双杂交试剂盒（Make Your Own “Mate&Plate” Library System）的要求构建水稻叶片靶标cDNA文库。利用快速重组克隆的方法构建pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2诱饵载体,并分别将它们转化至酵母菌株Y2H Gold,提取细胞总蛋白后利用Western blot检测Pikh1和Pikh2的表达情况,并对这2个诱饵载体自激活和毒性分析后进行酵母双杂交筛选。提取SD/-Ade/-Leu/-Trp/ -His/X-α-Gal筛选平板培养基上呈蓝色的酵母单克隆的质粒,将其分别与对应的诱饵载体共转化酵母菌株Y2H Gold,涂布于筛选平板培养基上进行互作的重复验证,将通过重复验证的质粒测序分析所得的序列比对水稻基因组数据库以确定目的基因,并对这些基因进行gene ontology（GO）注释分析以确定其分子功能、生物过程及细胞组成。【结果】靶标cDNA文库的库容量约为2.2×10⁶,插入片段长度均大于400 bp,表明水稻cDNA文库质量高。诱饵载体pGBKT7-Pikh1和pGBKT7-Pikh2均能在酵母细胞中正确表达出对应的Pikh1及Pikh2蛋白,无自激活活性而且对酵母无毒性作用,符合文库筛选的要求。利用含有诱饵载体的酵母菌株Y2H Gold与靶标文库菌株Y187结合（Mating）的方式筛选,获得13个与Pikh-1相互作用的蛋白、5个与Pikh-2相互作用的蛋白,其中有2个与Pikh-1及Pikh-2同时存在相互作用。这些蛋白包括4个在逆境响应或激素信号转导过程中起到重要作用的（辅）转录因子、3个信号蛋白、4个参与光合作用的叶绿体蛋白、1个含有U-BOX结构域的蛋白及4个未知功能蛋白。【结论】成功构建了适宜于研究抗病基因（R基因）介导反应途径的酵母双杂交cDNA文库,筛选出Pik-h的互作蛋白,为进一步研究Pik-h或其他抗稻瘟病基因介导的抗病机制打下了基础。     

鸡胚成纤维细胞cDNA文库构建及其与禽呼肠孤病毒σA相互作用宿主蛋白的筛选

[目的]构建鸡胚成纤维细胞(CEF)的cDNA文库并筛选与禽呼肠孤病毒(ARV)σA蛋白相互作用的宿主蛋白,为揭示互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制打下基础.[方法]采用TRIzol法提取CEF细胞总RNA,以SMART技术和LD-PCR合成双链cDNA(ds cDNA),ds cDNA和pGADT7-Rec共转化Y187酵母感受态细胞,构建cDNA文库;将pGBKT7-σA诱饵质粒转至Y2HGold酵母感受态细胞中,并与构建的cDNA文库进行酵母双杂交筛选,筛选出的候选文库菌经质粒提取后与pGBKT7-σA诱饵质粒再共转化Y2HGold酵母菌,筛选出能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba固体培养基上生长且明显变蓝的菌落,最后提取蓝色酵母菌质粒进行测序分析.[结果]构建的CEF细胞cDNA文库库容为1.6×106 CFU,文库滴度为3.1×108 CFU/mL,插入片段大小集中在300~2000 bp,重组率为91.67%.以含有pGBKT7-σA的Y2HGold酵母菌与cDNA文库酵母菌进行双杂交,阳性克隆能在SD-/Trp/-Leu/-Ade/-His/X-α-Gal/Aba(SD/-4/X/A)固体培养基上长出菌落且明显变蓝,测序结果显示共筛选出4个能与σA蛋白相互作用的宿主蛋白,分别是初期多肽相关复合体α亚基(NACA)、核苷二磷酸激酶2(NME2)、假定蛋白及线粒体核糖体蛋白S9(MRPS9).[结论]通过SMART技术构建的CEF细胞cDNA文库具有较好的库容和滴度,且从cDNA文库中筛选出4种与ARVσA蛋白相互作用的宿主蛋白,为后续研究互作蛋白对ARV复制及凋亡的分子调控机制提供了可靠数据.