ST1肠毒素基因的合成,克隆及其融合蛋白的高效表达

用ＤＮＡ合成仪合成了编码ＳＴ１肠毒素第５８到７２位氨基酸残基的ＤＮＡ片段，并将其与表达融合蛋白的载体ＰＧＥＭＥＸ－１重组，转化受体菌ＪＭ１０９（ＤＥ－３）筛选出重组克隆经过１ＰＴＧ４小时诱导，ＳＴ１融合蛋白的产量超过细菌蛋白总量的４０％，最高达５９．９％。     

ST1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析

用ＳＡｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－１５０凝胶和ＥＤ－３２离子交换层析，从重组菌ＰＧＥＭＳＴ２株内分离，纯化ＳＴ１，肠毒素融合蛋白，回收的ＳＴ１肠毒素融合蛋白占细菌总蛋白的３１．５％。ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳条件呈一条蛋白带。ＳＴ１肠毒素融合蛋白不溶于甲醇，乳鼠试验阴性。     

猪带绦虫六钩蚴抗原基因的克隆与表达

以λｇｔ１１为载体构建了猪带绦虫六钩蚴ｃＤＮＡ文库，从中筛选出５株表达六钩蚴抗原成分的重组噬菌体。将其中的六钩蚴ｃＤＮＡ与表达质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ２连接，在ＴＧ１大肠杆菌中高效表达，获得了２株表达ＧＳＴ－六钩蚴抗原融合蛋白（Ｍｒ分别为５×１０４和６×１０４）的工程菌。在ＬＢ营养液中添加１％乳糖和０．２％葡萄糖，工程菌的表达效果优于用ＩＰＴＧ诱导的效果。融合蛋白约占工程菌总蛋白的２３％。     

ST_1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析

用ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１５０凝胶和ＤＥ３２离子交换层析，从重组菌ＰＧＥＭＳＴ２株内分离、纯化ＳＴ１肠毒素融合蛋白，回收的ＳＴ１肠毒素融合蛋白占细菌总蛋白量的３１５％。ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶电泳条件呈一条蛋白带。ＳＴ１肠毒素融合蛋白不溶于甲醇、乳鼠试验阴性。对小鼠皮下注射使用安全，对Ｋ９９强毒菌攻击贩保护率达６０％。ＰＧＥＭＳＴ２菌株可以做为预防仔猪腹泻疫苗的候备菌株     

猪带绦虫六钩抗原基因的克隆与表达

以λｇｔ１１为载体构建了猪带绦虫钩蚴ｃＤＮＡ文库，从中筛选出５株表达六钩蚴抗原成分的重组噬菌体。将其中的六钩蚴ｃＤＮＡ与表达质粒ＰＧＥＸ－４Ｔ２连接，在ＴＧ１大肠杆菌中高效表达，获得了２株表达ＧＳＴ－六钩蚴抗原融合蛋白（Ｍｒ分别为５×１０＾４和６×１０＾４）的工程菌。在ＬＢ营养液中添加１％乳糖和０．２％葡萄糖，工程菌的表达效果优于用ＩＰＴＧ诱导的效果。融合约占工程菌总蛋白２３％。     

表达大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合蛋白双价基因工程菌株的构建

重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ 融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３．２１％ ,而且已失去天然ＳＴ１肠毒素生物毒性。用从ＩＰＴＧ 诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗１．５ＭＬＤ 的大肠杆菌强毒株Ｃ８３９０２（Ｋ８８ａｃ,ＳＴ＋ ,ＬＴ＋ ）的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性。这表明构建的工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株     

大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１,回收０８４ｋｂ的ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因,再将载体ｐＥＴ—２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,然后将其与ＳＴ１—ＬＴＢ融合基因连接,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ、ＨｉｎｄⅢ、ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒ｐＸＥＴＳＬＴ１。重组菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＸＥＴＳＬＴ１）经ＩＰＴＧ诱导后,其表达产物经ＳＤＳ—ＰＡＧＥ和ＥＬＩＳＡ检测,结果表明重组菌株可以高效表达ＳＴ１—ＬＴＢ融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的３３２１％,而且无天然ＳＴ１生物毒性。     

大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ融合基因的构建及其免疫原性研究

用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和Ｂｇ１Ⅱ双酶切质粒ｐＢＳＴ２－６，获得了大肠杆菌耐热性肠毒素Ⅰ（ＳＴ１）基因，再将含ＬａｃＺ基因（编码β－半乳糖苷酶）的载体ｐＵＣ１８用ＢａｍＨＩ酶切、碱性磷酸酶处理，然后与ＳＴ１基因通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化至受体菌ＤＨ５α中。通过菌落原位杂交筛选，共筛选出５３个ＳＴ１基因探针杂交阳性的重组子，对其中一个重组子ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）进行限制性核酸内切酶酶切分析和核苷酸序列分析，证明重组质粒ｐＸＳＴ１含有２个正向串连在一起的ＳＴ１基因，而且融合在ＬａｃＺ基因的上游，具有正确的阅读框架。又ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）菌株能在含Ｘ－Ｇａｌ的ＬＢ平板上长成蓝色菌落，而且ＥＬＩＳＡ也检测到ＳＴ１融合蛋白，这表明该菌株能表达具有β－半乳糖苷酶活性的大肠杆菌ＳＴ１—β－半乳糖苷酶融合蛋白。免疫实验结果表明，重组菌株ＤＨ５α（ｐＸＳＴ１）安全无毒，表达的ＳＴ１融合蛋白能够诱发ＢＡＬＢ／ｃ鼠产生抗体，该抗体具有中和天然ＳＴ１肠毒素的毒性作用，这表明ＤＨ５α（ｐＸＴ１）可以作为预防幼畜腹泻的菌苗候选株。     

鹅Ⅰ型禽副粘病毒融合蛋白基因3‘端cDNA片段的分子克隆

参考禽副粘病毒的融合蛋白基因（Ｆ基因）ｃＤＮＡ序列，设计并合成了１对引物，以他离到对鹅有致病力的Ⅰ型禽副粘病毒ＧＰＭＶ／ＱＹ９７－１株的核酸（ＲＮＡ）为模板，用逆转录聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）对其融合蛋白基因３＇端进行扩增，获得了预计的８８４ｂｐ左右的片段。将该片段克隆进ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ质粒载体，获得重组质料Ｔ－ＧＰＭＶＦ３＇，采用限制性内切酶和ＰＣＲ方法对该重组质粒进行鉴定，证明所克隆的     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的构建

用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌不耐热肠毒素（ＬＴＢ）基因的质粒ｐＸＬＴ１－１,回收５０５ｂｐ的ＬＴＢ基因片段,再用ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌耐热肠毒素（ＳＴ１）基因的质粒ｐＸＳＴ１,与上述回收的ＬＴＢ基因片段连接,转化至受体菌ＪＭ１０９中。经ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄⅢ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组子质粒ｐＸＳＬＴ１。ＥＬＩＳＡ检测到了ＳＴ１－ＬＴＢ融合蛋白,而且该融合蛋白无天然ＳＴ１生物毒性。     

核基质附着区(MAR)调控的人胰岛素样生长因子(hIGF-1)转基因兔的制备

用ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子－１（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６只受体兔，有８只妊娠，共产下１９只活仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ，应用ＰＣＲ技术分析其外源基因整合情况，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ条带）。再对８只阳性兔的ＰＣＲ产物进行Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，得到５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１外源基因的转基因兔，转基因整合率为２６．３％（５／１９）。用１只阳性转基因公兔（５０２号）繁殖了６窝，共获得４２只仔兔。采仔兔耳样提取基因组ＤＮＡ后，如上用ＰＣＲ分析和做Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交，Ｆ１代中有５只整合有ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１融合基因。     

表达CPB—ST融合蛋白工程菌株的免疫原性研究

已构建的能表达产气荚膜菌β－毒素和大肠埃希氏菌ＳＴ融合蛋白的基因工程菌株ＢＬ２１（ＤＥ３,ｐＥＣＢ－ＳＴ１）及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从ＩＰＴＧ诱导的工程菌株中提取的包涵体和经甲醛灭活的工艺菌株全菌体制备抗原免疫小白鼠,攻毒试验结果表明,免疫小白鼠能分别抵抗１ＭＬＤ的Ｂ型产气荚膜梭菌强毒株和产ＳＴ的大肠埃希氏菌工程菌株ＨＢ１０１（ｐＳＬＭ００４）的攻击。     

核基质附着区（MAR）调控的胰岛素样生长因子（hIGF—1）转基因兔…

用ＥｏｏＲＩ＋ＨｉｎｄⅢ双酶解含鸡α－珠蛋白基因５′端核基质附着区（ＭＡＲ）、小鼠金属硫蛋白基因启动子（ＭＴ－１）和人胰岛素样生长因子１－（ｈＩＧＦ－１）基因的ｐＭＴＳＭＣＡＧ质粒，０．６％琼脂糖凝胶电泳，玻璃乳回收纯化ＭＡＲ／ＭＴ／ｈＩＧＦ－１片段（３．９ｋｂ），用该片段制备转基因兔。利用水平显微注射系统注射１－细胞兔胚胎４６８枚，移植到３６中受体兔，获得８只阳性兔（显示出约６００ｂｐ外源ＤＮＡ     

大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的高效表达

用限制性核酸内切酶Ｅｃｏ ＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因的质粒ｐＸＳＬＴ１,回收０．８４ｋｂ的ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因,再将载体ｐＥＴ－２８ｂ（＋）用ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ双酶切,然后将其与ＳＴ１－ＬＴＢ融合基因连接,转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＥｃｏＲⅠ,ＨｉｎｄⅢ,ＢａｍＨⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒ｐＸＥＴ－ＳＬＴ１。     

马立克氏病病毒６４８株囊膜糖蛋白gI基因的克隆和表达的研究

根据马立克氏病病毒（ＭＤＶ）强毒株ＧＡ的基因序列，设计和合成一对引物，以特超强毒６４８株基因组ＤＮＡ为模板，通过ＰＣＲ技术，扩增其囊膜糖蛋白gI基因阅读框（ＯＲＦ）中，除去其Ｎ－端编码疏水区的１６５个碱基对（bp)以外的蓁部分；将ＰＣＲ产物按正确的阅读框架定向克隆到表性载体pGEX-6P-1中谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）基因的下游，将重组质粒转化进大肠杆菌ＢＬ２１株，在１．０mMIPTG浓度和３０℃的条件下诱导，gI-GST基因融合蛋白获得了理想的表达；经聚丙烯酰胺凝脉电泳，West-ern-blot试验，通信班下其表达的融合蛋白产物大小为预期的６３ＫＤ。将表达产物回收后免疫小鼠，所得抗血清可与ＭＤＶ感染的鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）在免疫荧光试验（ＦＡ）中呈细胞膜阳性染色。试验结果表明，在大肠杆菌中表达的６４８株ＭＤＶgI基因的融合蛋白产物保留了天然蛋白的某些抗原性。     

重组日本血吸虫中国大陆株28kuGST免疫刺激复合物对小白鼠的免疫试验

将体外重组的日本血吸虫中国大陆株２８ｋｕ谷胱甘肽－Ｓ－转移酶与免疫,刺激复合物（ＩＳＣＯＭ）结合制备了ｒＳｊ２８ＧＳＴ－ＩＳＣＯＭ。用含８５μｇ ｒＳｊ２８ ＧＳＴ的ｒＳｊ２８ＧＳＴ－ＩＳＣＯＭ及１００μｇ ｒＳｊ２８ＧＳＴ分别免疫ＢＡＬＢ／ｃ小白鼠,用常规ＥＬＩＳＡ检测体液免疫水平,以日本血吸虫大陆株尾蚴攻击后的减虫率表示免疫保护力。     

猪生殖与呼吸综合征病毒ORF6片段的cDNA克隆及鉴定

根据已发表的ＰＲＲＳＶ基因组序列，设计并合成了１对特异扩增ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２株的ＯＲＦ６的基因的引物，以ＡＴＣＣ ＶＲ－２３３２基因组为模板，通过ＲＴ－ＰＣＲ扩增出５８６ｂｐ的ｃＤＮＡ产物。将该ｃＤＮＡ片段经Ｔ－Ａ连接插入ｐＧＥＭ－Ｔｅａｓｙ载体中，用重组质粒转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９，获得重组质粒转化菌。对重南粒ＤＮＡ进行ＰＣＲ及酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片段与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相     

hEPO乳腺定位表达载体的构建及其在大鼠和家兔乳腺中的暂时表达

将人红细胞生成素（ｈＥＰＯ）基因组ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）与大鼠乳清酸蛋白（ＷＡＰ）基因的上游调控序列融合,分别构建了ＰＷＡＰＥＰＯ－ＷＡＰ３‘ＵＴＲ（ＰＷＥ３’）和ＰＣＭＶ－ＷＡＰ－ＥＰＯ－ＢＨＧｐｏｌｙ（ｐＣＷＥＡ）２个乳腺中位表达载体,表达载体经脂质体包裹后,以显微外科方法,经乳腺导管注入妊娠中后期大鼠和家兔腺内,进行暂时表达。分别大于分娩后４８、７２ｈ,家兔分娩后１－１０ｄ采奶,ＥＬＩＳＡ方法检     

鸡毒支原体PCR检测及特异扩增片断的克隆与测序

根据Ｅ．Ｒ．Ｎascimento等人鸡毒支原体（Ｍycoplasma gallisepricum,ＭＧ）基因文库 分离的种特异性片段fＭＧ－２序列,设计合成一对长２５bp的引物Ｌ１Ｒ１,经ＰＣＲ反 应条伯优化选择,对５株ＭＧＤＮＡ扩增均产生出预期的７３２bp特异扩增片断,而不能扩增滑液支原体（Ｍycoplasma synouiae,ＭＳ）、Ｅ．coli、ＰＵＣ１９质粒ＤＮＡ,符合 设计要求;ＤＩＧ随机引物法标记扩增产物ＤＮＡ探针,与上述菌株ＤＮＡ Ｄot-blot杂交     

传染性法氏囊病病毒变异株主要免疫原基因cDNA的克隆及鉴定

采用反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ），从１株传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）本地分离株ＧＺ９０２中扩增到编码ＩＢＤＶ主要免疫蛋白ＶＰ２的ｃＤＮＡ片断，大小约为１３５０ｂｐ。将该ｃＤＮＡ片断插入ｐＢｓＫ质粒中，用重组质粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ，成功获得重组质粒转化菌。对重组质粒ＤＮＡ进行酶切鉴定，证明插入的ＤＮＡ片断与ＰＣＲ扩增的ＤＮＡ片段大小相符。对ＧＺ９０２高可变区进行了序列分析。其核苷酸序列与３株ＩＢ－ＤＶ变异株Ａ、ＧＬＳ、Ｅ的同源性分别达到９８．９％，９６．２％和９５．５％。而与其他Ⅰ型毒株的同源性较低。比较从ＤＮＡ序列推导出的氨基酸序列，发现ＧＺ９０２高可变区的两个亲水区均发生了一个氨基酸的变化，而在２４９和２５４位上的氨基酸分别为Ｋ和Ｓ，与以上３个变异株相同，但与所有标准Ⅰ型毒株不同。这两个氨基酸可以作为ＩＢＤＶ变异株的标志。