SPA/SPG融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达

葡萄球菌A蛋白（SPA）和链球菌G蛋白（SPG）的IgG结合区编码基因融合后，克隆到大肠杆菌表达载体PGEX，SPA／SPG融合蛋白（SPAG）得到高效表达。可溶性SPAG～GST产物可被谷胱甘肽亲和柱一次性纯化。用琼扩和ELISA试验测定了表达产物与不同种属动物血清反应的性能。SPAG—GST与所有SPA、SPG各自反应的动物IgG结合，对小鼠IgG的反应优于SPA或SPG。在所测试的23种动物血清中，融合蛋白与大部分哺乳动物Ig反应。     

猪圆环病毒2型Rep蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

本研究旨在制备猪圆环病毒2型(PCV2)Rep蛋白单克隆抗体。PQE30-PCV2Rep蛋白在IPTG的诱导下表达,用SDS-PAGE对表达产物进行检测。将纯化的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,ELASA法鉴定抗体亚型及效价。结果显示重组蛋白PQE30-PCV2Rep得到高效表达,筛选获得了3株稳定分泌抗Rep蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系1G4、2G4和6H12,其分泌的抗体分别为IgG2a、IgG2b、IgG2b亚型。其中,6H12抗体效价为256K,浓度为0.47mg/mL,纯度90%。本研究制备的单克隆抗体有较好的生物学特性,为PCV2的研究及快速诊断提供了新的方法。     

链球菌GapC蛋白的表达及其多克隆抗血清的制备

本研究对乳房链球菌GapC蛋白基因进行了克隆、重组表达、蛋白纯化和免疫原性试验。应用PCR技术直接从临床分离的乳房链球菌菌株基因组中扩增出GapC蛋白基因,并将其克隆至pET28a（＋）上,转化大肠杆菌BL21（DE3）中表达。经DNA序列测定分析,扩增出的基因与GenBank发表的乳房链球菌GapC基因序列AF421900的同源性为99．8％。氨基酸同源性为100％;与GenBank发表的无乳链球菌GapC基因序列AF421899的同源性为91．4％;与停乳链球菌GapC基因序列AF375662的同源性为88．9％。表达的融合蛋白通过MagneHis^TM蛋白纯化试剂盒纯化,纯化蛋白免疫小鼠3次,制备GapC抗血清。本研究表达和纯化了乳房链球菌GapC蛋白,并制备出鼠抗血清,为下一步开展GapC重组蛋白的应用研究莫定了基础。     

家蚕G蛋白γ1亚基(BmGγ1)的克隆及其谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白的表达与纯化

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子,参与生物体广泛的信号转导。为了研究家蚕体内G蛋白的生理功能及其作用机制,运用生物信息学方法预测了家蚕G蛋白γ1亚基(Gγ1)的序列,设计引物验证预测序列后,克隆了家蚕Gγ1的序列,再通过酶切克隆至表达载体pET-41b(+)后,导入E.coliBL21宿主菌中,经异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组谷胱甘肽硫转移酶(glutathione s-transferase,GST)融合蛋白,并亲和层析纯化表达产物。家蚕Gγ1重组GST融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot分析,在分子质量约36 kD处出现特异性蛋白条带,重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后,得到了高纯度的融合蛋白,说明已经成功克隆到家蚕Gγ1基因,并在E.coliBL21中高效表达。     

家蚕G蛋白诅亚基（BmGγ1）的克隆及其谷胱甘肽硫转移酶融合蛋白的表达与纯化

异三元G蛋白是真核细胞感知外界信号后将信号传递到胞内的重要分子，参与生物体广泛的信号转导。为了研究家蚕体内G蛋白的生理功能及其作用机制，运用生物信息学方法预测了家蚕G蛋白γ1亚基（Gγ1）的序列，设计引物验证预测序列后，克隆了家蚕Gγ1的序列，再通过酶切克隆至表达载体pET-41b（＋）后，导入E．coli BL21宿主菌中，经异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达重组谷胱甘肽硫转移酶（glutathione s-transferase，GST）融合蛋白，并亲和层析纯化表达产物。家蚕Gγ1重组GST融合蛋白经SDS-PAGE电泳和Western blot分析，在分子质量约36 kD处出现特异性蛋白条带，重组蛋白经GST亲和层析柱纯化后，得到了高纯度的融合蛋白，说明已经成功克隆到家蚕Gγ1基因，并在E．coli BL21中高效表达。     

基因工程产品SPAG简介

葡萄球菌A蛋白(SPA)发现于1940年,70年代后得以广泛应用。尽管一些金黄色葡萄球菌可以分泌丰富的SPA,但其应用范围远不及链球菌G蛋白(SPG)。SPG发现于70年代,但G组链球菌难以培养,SPG的分泌量也少,而且纯化步骤复杂;此     

大鼠成熟的肺表面活性蛋白B的原核表达及纯化

为表达和纯化SP-B蛋白,先对SP-B基因进行稀有密码子优化,PCR反应获得SP-B片段,构建重组质粒pGEX4T-1/SP-B,转化到E.coli BL21(DE3)中诱导表达;用SDS-PAGE与Western blot进行检测;用GSTPrep FF 16/10对融合蛋白进行纯化。经双酶切鉴定证实质粒中插入基因长250bp,测序结果与大鼠SP-B cDNA序列相符;质粒转化后用IPTG进行诱导,在分子质量约34ku处出现1个新条带,与pGEX4T-1/SP-B蛋白预期大小一致,且该融合蛋白能可溶性表达并被纯化。结果表明成功构建了pGEX4T-1/SP-B重组质粒,表达、纯化得到GST/SP-B蛋白,为研究肺表面活性物质替代药物奠定了基础。     

多头带绦虫Tm16与Tm18抗原基因的克隆及原核表达

为原核表达Tml6和Tm18重组蛋白,本研究以自然感染羊源脑多头坳原头节基因组DNA为模板分别扩增Tml6和Tm 18杭原基因全基因片段,测序鉴定后合成其开放阅读框架DNA片段,将基因组序列中的内含子去除并对其稀有密码子进行改造优化,构建重组表达质粒pGEX-Tm 16和pGEX-Tml8.转化大肠杆菌BL21后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物并进行纯化.结果显示:在大肠杆菌中表达出带有GST标签的大小约为39.6 ku和39.4 ku的重组蛋白,经谷胱甘肤琼脂糖树脂纯化得到高纯度的可溶性的GST-Tm 16及GST-Tml8重组蛋白,western blot分析表明重组蛋白均能够被兔抗GST单克隆杭体特异性识别.     

鸡L-FABP抗血清制备及组织表达特性分析

为制备鸡肝脏型脂肪酸结合蛋白（L-FABP）的多克隆抗血清,并分析L-FABP的组织表达特性,利用RT-PCR扩增L-FABP基因,构建鸡L-FABP基因的GST融合蛋白表达质粒pGEX-4T／L-FABP。将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导产生GST／L—FABP融合蛋白,用亲和层析纯化目的蛋白,将纯化的GST／L—FABP融合蛋白免疫家兔制备抗血清,并利用此抗血清分析鸡0FABP基因的组织表达特性。诱导得到了1个40ku（14ku L—FABP＋26kuGST）的融合蛋白,获得效价较高、特异性强的鸡L-FABP的抗血清。鸡L-FABP的组织表达特性研究结果表明,该基因在肝脏和小肠组织中有较高表达,但在心脏、脂肪、肌肉、肌胃、脾、肺和肾中没有检测到表达信号。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型(PCV3)重组核衣壳(Cap)蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

猪圆环病毒3型新疆株Cap蛋白的原核表达及纯化

本研究旨在通过构建pGEX-4T-1-Cap原核表达载体,制备猪圆环病毒3型（PCV3）重组核衣壳（Cap）蛋白抗原。将密码子优化的PCV3 Cap全基因插入pGEX-4T-1载体,构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap,转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,筛选出最佳诱导条件,通过谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化重组Cap蛋白。结果表明,成功构建重组质粒pGEX-4T-1-Cap;在IPTG终浓度为0.1 mmol/L、16 ℃诱导20 h的条件下,可获得大量可溶性重组Cap蛋白,SDS-PAGE结果表明分子质量在51.6 ku,与预期相符;Western blotting分析表明经纯化的Cap蛋白与鼠抗GST单克隆抗体、PCV3兔源阳性血清呈阳性反应,进一步证实了重组蛋白的表达。本研究表达并纯化了PCV3 Cap重组蛋白,为新型基因工程亚单位疫苗的研制和ELISA血清学诊断方法的建立奠定了基础。     

布鲁氏菌DnaJ蛋白的表达及功能分析

本试验旨在运用分子生物学与生物信息学方法对布鲁氏菌DnaJ蛋白进行分析;将该蛋白进行原核表达,并检验纯化蛋白在体外或体内诱导Th1和Th2型免疫反应的能力。以布鲁氏菌M5-90为模板成功扩增目的基因DnaJ,构建重组表达载体pET-30a-DnaJ;利用SDS-PAGE检测DnaJ重组蛋白在大肠杆菌中的表达,并对其进行纯化;用DnaJ蛋白刺激RAW 264.7细胞和小鼠脾细胞,并用DnaJ蛋白免疫小鼠;利用ELISA试剂盒检测细胞因子IFN-γ、IL-4及小鼠血清中IgG1和IgG2a抗体水平的变化。结果显示,DnaJ蛋白二级结构以无规则卷曲结构为主,该蛋白有11个抗原决定簇;SDS-PAGE结果显示,重组菌在37.7 kDa大小的位置有特异表达条带,获得了DnaJ纯化蛋白;DnaJ蛋白可诱导宿主细胞和小鼠产生高水平IFN-γ、IL-4、IgG1和IgG2a抗体。鉴于DnaJ蛋白可在体外或体内诱导Th1和Th2型免疫反应,有望成为布鲁氏菌病的候选亚单位疫苗。     

传染性造血器官坏死病病毒G基因全长cDNA克隆及重组表达研究

本研究旨在克隆G基因全长并与其他传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)株进行分析,为IHNV的预防检测提供依据。通过提取IHNV-G蛋白RNA并进行扩增,将其克隆到p MD-18T并与p Chlamy-4载体相连,重组到莱茵衣藻中并提取总蛋白,结果可得:扩增片段长度为1 500 bp,经SDS-PAGE电泳得到一条大约为58 k Da的蛋白条带,Westen Blot分析结果显示,重组莱茵衣藻所表达的蛋白可以与6×HIS标签抗体特异性结合;并且以重组表达的G蛋白为抗原,鼠抗IHNV血清为一抗,辣根过氧化物酶标记的驴抗鼠IgG为二抗,再次进行Westen Blot检验,其结果显示,经诱导后的G蛋白能与鼠抗IHNV血清反应,并在58 k Da处出现了一条明显的特异性条带,具有良好的反应原性。表明重组莱茵衣藻表达系统构建成功。     

猪链球菌4型GalR蛋白的生物信息学分析及原核表达

试验旨在了解猪链球菌4型（Streptococcus suis serotype 4，SS4）转录调控因子GalR蛋白生物学信息并对其进行原核表达。使用相关生物信息学分析网站对SS4 SH1510菌株GalR蛋白进行序列同源性和功能结构域检索，并对信号肽、跨膜区和等电点进行预测；同时，对SS4 SH1510菌株GalR基因进行扩增、原核表达、纯化，并用SDS-PAGE分析重组蛋白的可溶性，用Western blotting鉴定重组蛋白的反应原性。氨基酸序列比对显示，SH1510菌株GalR蛋白与变形链球菌、无乳链球菌、绿脓杆菌、马链球菌兽疫亚种、肺炎链球菌、口腔链球菌及李斯特菌的GalR家族蛋白的氨基酸序列分别具有57%、56%、55%、55%、52%、52%和49%的同源性；结构域检索发现GalR蛋白N-末端具有螺旋-转角-螺旋（helix-turn-helix，HTH）基序的小DNA结合结构域，C-末端具有Ⅰ型周质结合蛋白折叠的调节配体结合域，在这两个功能结构域的中间含有一个约18-氨基酸的连接子；GalR蛋白无信号肽，无跨膜区，等电点为5.10。SDS-PAGE分析显示，GalR蛋白绝大部分表达在上清，分子质量为56 ku；Western blotting鉴定结果显示，His单克隆抗体和粗制SS4多克隆抗体兔血清能特异性识别可溶性GalR蛋白。本研究对GalR蛋白进行了生物信息学分析并成功地表达和纯化了GalR蛋白，为进一步研究GalR蛋白在SS4中的作用奠定了基础。     

鸭肠炎病毒VP22蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备抗鸭肠炎病毒(DEV)VP22蛋白的单克隆抗体(MAb),本研究以DEV Clone-03基因组DNA为模板,通过PCR方法扩增UL49基因并克隆至pMD-18载体.重组质粒经测序鉴定后,将UL49基因亚克隆于原核表达载体pET-30a,构建重组表达质粒pET-30a-UL49.重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经IPTG诱导,在大肠杆菌中获得表达,并对表达的重组蛋白VP22进行western blot鉴定.结果显示,表达的重组蛋白分子量约为36 ku,与预期的大小一致.重组蛋白能够被鼠抗DEV阳性血清所识别,表明该重组蛋白具有良好的免疫原性.将重组蛋白纯化、复性后免疫BALB/c小鼠,制备MAb,经间接ELISA、western blot和间接免疫荧光试验进行筛选及鉴定.获得4株能够稳定分泌抗DEV VP22蛋白MAb的杂交瘤细胞株,分别命名为2810、2G1、3F10和3G2.其MAb亚类分别属于IgG2b、IgG2b、IgA和IgM.4株MAbs都能够与DEV Clone-03发生特异性反应,表明能够识别天然构象的VP22蛋白.这4株MAb可用于DEV VP22蛋白功能研究及抗原表位的研究.     

布鲁氏菌BP26蛋白的原核表达及单克隆抗体的制备

布鲁氏菌是布鲁氏菌病的病原,严重危害畜牧生产及人类健康。本研究扩增布鲁氏菌BP26基因,构建了重组质粒pET-32a-BP26,经双酶切鉴定后转化至BL21(DE3)感受态细胞诱导表达并纯化,得到了重组BP26蛋白;将纯化后的重组BP26蛋白免疫BALB/c雌性小鼠,筛选得到8株IgG亚型阳性杂交瘤细胞株,经验证制备的单克隆抗体可与抗原特异性结合,为布鲁氏菌检测方法的建立及后续研究奠定了基础。     

猪细环病毒2型衣壳蛋白的原核表达及纯化

本试验通过在大肠杆菌中表达衣壳蛋白,确定最优表达条件并对其进行纯化。用PCR法扩增猪细环病毒2型（TTV2）ORF1抗原基因,定向克隆至质粒pGEX-4T-1中,获得重组质粒pGEX-4T-1-ORF1。经双酶切鉴定及测序正确后转化到BL21(DE3)工程菌中,获得衣壳蛋白大肠杆菌表达株。IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,并对影响重组蛋白表达的3个因素,即诱导时间、诱导温度和IPTG浓度进行优化,确定最优表达条件。重组表达质粒PCR及双酶切鉴定结果显示衣壳蛋白原核表达载体构建正确。重组融合蛋白分子质量约80 ku,主要以包涵体形式存在。37 ℃诱导5 h表达量最多,IPTG浓度对表达量无明显影响。蛋白质串联肽谱分析检测氨基酸序列与GenBank中公布的TTV2 ORF1基因序列翻译的氨基酸序列相对应,且可被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别。该融合蛋白首次用KCl染色切胶回收法对表达的融合蛋白进行纯化,纯化效果较好,性价比高。结果表明,成功构建了pGEX-4T-1-ORF1重组质粒,衣壳蛋白得到了高效表达及纯化,为间接ELISA的建立及单克隆抗体的研制提供了抗原。     

奶牛早孕因子重组蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

本研究旨在表达、纯化奶牛早孕因子重组蛋白及制备多克隆抗体.本试验构建奶牛早孕因子重组蛋白原核表达载体pET32a-EPF,转化至大肠杆菌BL21(DE3)内进行诱导表达,SDS-PAGE切胶纯化的早孕因子重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,并用Western blotting和ELISA对重组蛋白及抗体进行检测.结果显示,成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,重组蛋白分子质量约37 ku,表达量约占菌体总蛋白的48.6%,纯化后目的蛋白纯度可达93%,重组蛋白可与所制备的多克隆抗体结合,ELISA测定的抗体效价为1:12 800.结果表明,本研究成功表达并纯化了奶牛早孕因子重组蛋白,为研究奶牛早孕诊断奠定基础.     

马链球菌马亚种8组分融合蛋白的表达及小鼠免疫效果的评价

马腺疫是由马链球菌马亚种(S. equi)引起的急性接触性马属动物传染病，严重影响幼驹的生长发育。我国尚无预防该病的有效疫苗，也缺乏S. equi动物感染和免疫保护模型。为在原核系统中表达马链球菌马亚种(S. equi)的多组分融合蛋白，并评价其对小鼠的免疫保护效果，本研究以S. equi HLJ2018株DNA为模板，分别经PCR扩增其cne、eag、SclC、SclI、SclF、eq5、eq8和ideE基因，并分别克隆至pGEX-6p-1载体中，构建表达这8个蛋白的重组质粒并分别经PCR和测序鉴定。通过在各基因之间引入蛋白接头Gly-Gly-Gly编码基因序列并利用同源重组技术依次串联该8个基因，得到融合基因se8，利用其构建重组质粒pET-28a-SE8 (His标签)及pGEX-6p-1-SE8(GST标签)，均经PCR和测序鉴定后，将这两个表达SE8及分别表达该8个蛋白的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，经IPTG诱导表达后采用亲和柱层析法纯化，采用SDS-PAGE检测各蛋白的表达及纯化效果；采用western blot检测各蛋白的反应原性。SDS-PAGE结果显示...     

家蚕核型多角体病毒(陕西株)orf126基因的表达及与几丁质的体外结合实验

为研究家蚕核型多角体病毒(BmNPV)orf126基因(Bm126)在感染宿主中的作用机制,采用PCR方法从BmNPV陕西株中克隆了切除N端23个氨基酸(预测信号肽序列)的Bm126基因,并将其和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合后在大肠杆菌中进行了表达。利用纯化的BM126重组蛋白与几丁质进行体外结合实验,Western blot分析没有检测到BM126重组蛋白与几丁质结合的复合物,推测原核表达的重组BM126融合蛋白在体外不能与几丁质结合。