多头带绦虫甘肃分离株线粒体NADH脱氢酶亚基Ⅰ基因片段差异分析

应用线粒体DNA中的NADH脱氢酶亚基Ⅰ(ND1)基因作为分子标记,对我国甘肃省景泰和平凉地区10个绵羊源脑多头蚴进行分析,构建系统进化树,分析其种内变异.结果表明,所有多头带绦虫(T.multiceps)分离株均成功扩增出约0.5kb的ND1基因片段.序列分析显示,去除引物序列后多头带绦虫的ND1基因片段长为488bp,可以分为9类,共有22个核苷酸变异位点,变异率为0.20%～2.66%.基于ND1序列的系统进化树表明所有T.multiceps分离株构成1个分支,可分为3个亚群,国内分离株分别处在不同的亚群中.国内分离株中除了与已知的遗传变异型Tm1(AY669089/Tm-JT081204/Tm-JT090331)和Tm3(DQ077820/Tm-JT080526)相同外,还存 在新的遗传变异型(Tm-JT081008/Tm-JT090603/Tm-JT090115-2),独立为一支,与其他分离株亲缘关系较远;表明ND1基因片段适合作为研究T.multiceps分离株种内变异的分子标记.     

多头带绦虫Tm16与Tm18抗原基因的克隆及原核表达

为原核表达Tml6和Tm18重组蛋白,本研究以自然感染羊源脑多头坳原头节基因组DNA为模板分别扩增Tml6和Tm 18杭原基因全基因片段,测序鉴定后合成其开放阅读框架DNA片段,将基因组序列中的内含子去除并对其稀有密码子进行改造优化,构建重组表达质粒pGEX-Tm 16和pGEX-Tml8.转化大肠杆菌BL21后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物并进行纯化.结果显示:在大肠杆菌中表达出带有GST标签的大小约为39.6 ku和39.4 ku的重组蛋白,经谷胱甘肤琼脂糖树脂纯化得到高纯度的可溶性的GST-Tm 16及GST-Tml8重组蛋白,western blot分析表明重组蛋白均能够被兔抗GST单克隆杭体特异性识别.     

鸡颗粒溶素的原核表达及生物活性分析

为了克隆表达纯化鸡颗粒溶素(chicken granulysin,ChGNLY)并进行活力鉴定。本试验以基因组数据库预测的ChGNLY基因为模板设计引物,对提取的鸡脾脏总RNA进行RT-PCR,扩增得到的ChGNLY基因插入pMD-19T载体中并测序。将测序正确的GNLY基因克隆至pGEX-6p-1,构建重组表达质粒pGEX-6p-1-GNLY,并将其转化至感受态BL21,IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE、Western-blotting和蛋白质谱鉴定融合蛋白的正确性。CellTiter-Glo~2.0Assay检测融合蛋白的生物学活性。另外,对GNLY的分子特性进行了生物信息分析。结果显示,测序结果显示克隆的ChGNLY片段长237bp,编码79个氨基酸,所表达的融合蛋白相对分子质量约为36 000。重组ChGNLY融合蛋白能特异性与人颗粒溶素抗体发生反应。纯化后的GNLY融合蛋白经CellTiter-Glo~2.0Assay检测,发现其具有剂量依赖性的细胞毒活性。系统发生分析显示GNLY可明显分为4个群。结构分析发现,ChGNLY活性区域表面带有大量正电荷,且位点保守。结果表明,本试验利用原核表达系统成功表达了具有生物学活性的ChGNLY,为ChGNLY后续功能的研究奠定理论基础。