内蒙古白绒山羊VEGF164基因毛囊特异性表达载体的构建及胎儿成纤维细胞的稳定转染

 【目的】构建绒山羊血管内皮生长因子164（vascular endothelial growth factor 164,VEGF164）基因的毛囊特异表达载体并稳定转染胎儿成纤维细胞,筛选获得稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】以pCDsRed2载体为基本骨架将VEGF164基因亚克隆到KAP6-1启动子下游,接续连接红色荧光蛋白表达元件,构建VEGF164基因毛囊特异表达载体pCDsRed2-KV（6.3 kb）。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】在构建的表达载体pCDsRed2-KV中,VEGF164基因被正确连接在毛囊特异性启动子KAP6-1下游,基因下游按顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因;外源KAP6-1启动子和VEGF164基因整合到细胞基因组中。【结论】成功构建稳定表达红色荧光蛋白和毛囊特异表达VEGF164的真核表达载体,稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过克隆技术获得转VEGF164基因绒山羊提供了条件。     

大鼠OSP-1启动子克隆与表达检测

[目的]克隆大鼠卵巢特异性启动子（OSP-1）片段,并在细胞水平检测该启动子调控标记基因的组织特异性表达。[方法]参考已知大鼠OSP-1序列设计特异性引物,PcR扩增大鼠OSP-1启动子片段并与已公布的大鼠OSP—1序列进行比较。将OSP-1启动子定向克隆到去除CMV的pEGFP—N1载体,构建真核表达载体pOSP—1—EGFP．N1;重组质粒在脂质体LipofectamineTM2000介导下,分别转染水牛的颗粒细胞、乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞,并于转染后12,24和48h在荧光显微镜下观察EGFP表达情况。【结果lOSP—l启动子扩增片段长480bp,与已公布的大鼠OSP-1序列的相似性达96％;应用启动子预测软件对所得序列分析表明,该扩增片段含有类似于TA—TAbox和CAATbox的核心启动顺式元件,并含有多个C／EBPbeta转录因子的结合位点;在颗粒细胞转染后12h可观测到绿色荧光表达,转染后24h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大,48h荧光细胞数量骤减,且死细胞增多;在乳腺上皮细胞和胎儿成纤维细胞均未检测到EGFP基因表达。[结论]大鼠OSP-1启动子控制下的EGFP基因可在水牛颗粒细胞中特异表达,为构建水牛卵巢特并性表达转基因载体奠定了基础。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞 #br#

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosin beta 4,Tβ4) 基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM 2 000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】 克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142 bp,其中包含135 bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(XM002706880.1)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4基因并稳定转染胎儿成纤维细胞

【目的】克隆内蒙古白绒山羊胸腺素β4(thymosinbeta4,Tβ4)基因,构建皮肤特异性表达载体,转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞,筛选出稳定表达红色荧光蛋白并可用于核移植的转基因细胞克隆。【方法】通过RT-PCR克隆Tβ4基因cDNA序列,然后与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成Tβ皮肤特异性表达载体pCDsRed-KT。外源表达载体以lipofectamineTM2000介导转染胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆。PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合。【结果】克隆了内蒙古白绒山羊Tβ4基因,cDNA全长142bp,其中包含135bp的完整ORF,编码44个氨基酸残基,氨基酸序列与已报道的牛胸腺素β4(NM_001002885)同源性为100%。测序显示构建的表达载体pCDsRed-KT中,Tβ4基因正确连接在皮肤特异性启动子KAP6-1下游,顺序连接CMV启动子和红色荧光蛋白基因,载体构建正确。PCR检测显示外源KAP6-1启动子和Tβ4基因整合到细胞基因组中,筛选出的转基因细胞高效表达红色荧光蛋白。【结论】克隆得到内蒙古白绒山羊Tβ4基因并构建成功其真核表达载体,可稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞,为下一步通过核移植方法获得转胸腺素β4基因绒山羊提供了条件。     

CMV启动子指导pDsRed2-1基因在牛胎儿成纤维细胞中的表达

目的:为了检测扩增所得CMV启动子能够指导下游基因序列表达,从而可以为构建其它真核表达载体提供实验基础和依据。方法:对pEGFP质粒上的CMV启动子进行扩增,并将其插入pDsRed2-1质粒红色荧光蛋白上游,构建pCMV-Red质粒转染牛胎儿皮肤成纤维细胞,对其进行荧光检测。结果:质粒转染牛胎儿皮肤成纤维细胞48h后,荧光激发细胞,发红色荧光。结论:扩增所得CMV启动子具有启动其下游基因表达的功能。pCMV-Red质粒可用于构建其它真核表达载体。     

HCV p7下调基因p7TP2启动子序列的克隆及转录活性检测

【目的】克隆p7TP2基因的启动子区域,并检测HCV p7TP2启动子的转录活性。【方法】通过分析确定p7TP2基因翻译起始密码子ATG上游1 203 bp至下游147 bp的基因组DNA序列作为启动子,克隆启动子片段并构建载体pCAT3-p7TP2-p和pGLB-p7TP2-p,转染HepG2细胞,应用CAT表达系统和双荧光素酶系统检测启动子活性。【结果】克隆了预测具有启动子活性的片段,成功构建了pCAT3-p7TP2-p和pGLB-p7TP2-p载体,转染pCAT3-p7TP2-p的HepG2细胞,CAT表达活性是转染pCAT3-Basic细胞的5.98倍;转染pGLB-p7TP2-p的HepG2细胞,双荧光素酶表达活性是转染pGLB细胞的9.67倍。【结论】克隆的p7TP2启动子序列与预测的序列一致,并且具有启动子转录活性。     

鸡 CVH启动子调控的绿色荧光蛋白报告载体的构建及鉴定

探索建立一种用绿色荧光蛋白对鸡原始生殖细胞进行标记分离的方法.克隆并测序鸡原始生殖细胞特异表达基因cvh1.6kb启动子序列.序列分析表明它含有类似于TATAbox和CAATbox的元件,在其远端上游区域还有多个GC富含区.将cvh基因启动子亚克隆到绿色荧光蛋白表达栽pegfp-1的多克隆位点,成功构建表达栽体pcvh-egfp.重组质粒在脂质体Lipofectamine<''TM>2000介导下分别转染鸡X期胚盘细胞和鸡胚成纤维细胞,并于转染后12h在荧光显微镜下观察转染效果.实验结果显示:在胚盘细胞转染后12h可观测到绿色荧光表达,转染后24h荧光细胞增多,细胞形态均呈圆形、体积较大;在鸡胚成纤维细胞未检测到gfp表达.实验结果说明,由cvh基因启动子控制下的gfp可在X期胚盘细胞特异表达,为利用流式分离技术PGCs标记分离、纯化研究奠定基础.     

山羊MyoG启动子的克隆和活性检测

【目的】肌细胞生成素(myogenin,MyoG) 是生肌调节因子(MRFs)基因家族中唯一能在骨骼肌细胞发育与生长过程中均可表达的调控因子, 在肌肉细胞分化过程中起着中心调控的作用,它正调控着骨骼肌卫星细胞向成熟肌细胞分化的过程,是唯一不可代替的生肌调节因子。MyoG基因在复制、扩增、基因激活、转录、翻译等多级水平上对肌肉发育进行调控。基因转录的起始阶段是机体生长发育因子进行调控的开端,而此阶段调控的实质是通过启动子和上游调控序列的相互作用,调控目的基因的表达。因此克隆MyoG基因的启动子,探讨启动子区域的启动活性,有助于从理论上揭示MyoG基因表达的关键调控位点,同时也有利于揭示肌肉发育调控的相关机理,为治疗人类相关疾病以及改良家畜肉质研究提供实验依据。本研究克隆山羊Myogenin（MyoG）基因的启动子区域,检测其在哺乳动物骨骼肌细胞内的启动活性。【方法】克隆山羊MyoG基因的启动子序列,连入pDsRed2基本骨架构建了以红荧光蛋白基因为标记基因的真核表达载体pDsRed-GoatMyoG(5.3 kb)。表达载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定后,分别转染体外培养的绵羊肌卫星细胞、肌管细胞和成纤维细胞,观察红色荧光蛋白表达情况,然后利用实时荧光定量PCR、Western blot和冰冻切片、免疫组化等技术检测细胞转染后标记基因mRNA 和蛋白在体外培养细胞中的的表达活性。pDsRed-GoatMyoG表达载体对小鼠进行肌肉注射,检测GoatMyoG启动子在体内组织中的启动特异性和效率。肌肉注射5 d后,分别取小鼠的注射腿肌肉组织、非注射腿肌肉组织、睾丸组织、肠组织和肝脏组织,通过实时荧光定量 PCR 检测标记基因DsRed在不同组织中的表达情况。【结果】克隆得到的MyoG启动子序列测序正确,载体pDsRed-GoatMyoG经酶切和测序鉴定,证实载体构建成功;转染质粒 pDsRed-GoatMyoG后,肌卫星细胞和肌管细胞在显微镜下均可观察到细胞发红色荧光,成纤维细胞没有红色荧光。通过实时荧光定量PCR检测得出,转基因肌管细胞内GoatMyoG 启动DsRed 基因表达mRNA 的相对量为14.07;通过Western blot技术检测出转基因肌管细胞含有GoatMyoG启动的DsRed蛋白质,在转基因成纤维细胞内没有检测到 DsRed 蛋白质,说明GoatMyoG启动子可在肌肉组织特异性启动外源基因表达。小鼠肌肉注射pDsRed-GoatMyoG质粒后,注射腿肌肉组织内GoatMyoG 启动DsRed 基因转录mRNA 的相对量为212.32,非注射腿肌肉组织内mRNA的相对量为39.76,注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内mRNA 的量均是其它组织的1.99倍以上。通过免疫组化技术在注射腿肌肉组织和非注射腿肌肉组织内均可检测到红色荧光蛋白,在睾丸、肠和肝脏内均未检测到DsRed 蛋白。【结论】山羊MyoG启动子可以特异性的在骨骼肌组织驱动外源基因的表达,是一种有效的肌肉特异性启动子。     

人H1启动子转录shRNA的细胞种属特异性研究

利用siDirect软件预测绿色荧光蛋白(GFP)基因特异性小干扰RNA(siRNA),将人工合成的相应shRNA插入含人H1启动子的pSuper载体,获得表达载体pSuper-shRNA,再将H1-shRNA插入表达GFP基因的peGFP-N1载体,获得表达载体peGFP-H1-shRNA。分别以pSuper-shRNA peGFP-N1和peGFP-H1-shRNA转染COS-1、293-T、鸡胚肝(CEL)和鸡胚成纤维(CEF)细胞,根据相同条件下GFP阳性细胞数及荧光强度变化判断产生的siRNA对GFP基因表达的沉默作用,比较人H1启动子在哺乳动物和禽源细胞中的转录活性。结果表明:人H1启动子在2种哺乳动物细胞中能有效转录shRNA,但在2种禽源细胞中的转录活性很弱,提示在禽源细胞中表达siRNA和进行基因沉默研究应选用禽源启动子。     

慢病毒载体介导成纤维细胞高效稳定表达绿色荧光蛋白

 试验尝试建立稳定表达外源基因的人成纤维细胞系。取成年男性包皮皮肤的皮下组织,分离培养人皮肤成纤维细胞,分别采用脂质体和慢病毒载体介导转染人皮肤成纤维细胞表达绿色荧光蛋白。结果显示,来自成年人包皮皮下组织的成纤维细胞呈梭形,具有快速的增殖和稳定的生长性能。脂质体介导转染的人皮肤成纤维细胞绿色荧光蛋白表达不稳定,阳性细胞表达率低,转染后的人成纤维细胞变得更为细长,细胞生长速度降低。慢病毒载体介导人皮肤成纤维细胞高效稳定表达绿色荧光蛋白,转染后细胞生长性能和形态没有变化,经过多次传代和冻存复苏对人皮肤成纤维细胞绿色荧光蛋白的表达没有影响,通过流式细胞仪对慢病毒介导表达绿色荧光蛋白的人皮肤成纤维细胞检测显示,绿色荧光蛋白表达阳性率为99.85%,并且表达绿色荧光蛋白的人皮肤成纤维细胞细胞均一程度为76.05%。试验证实了慢病毒载体能够高效稳定介导人皮肤成纤维细胞表达绿色荧光蛋白。     

梅花鹿耳成纤维细胞体外培养及转染条件优化

为开展目标蛋白质在梅花鹿耳成纤维细胞的功能研究提供理论和技术依据,培养梅花鹿耳成纤维细胞,优化脂质体转染梅花鹿耳成纤维细胞的条件,以获得最优质粒转染参数。采用组织块贴壁法和差速贴壁法分离梅花鹿耳成纤维细胞,观察细胞基本形态特征变化,免疫荧光法鉴定波形蛋白（Vimentin）的表达;以增强型绿色荧光蛋白（EGFP）基因为标记基因,利用LipofectamineTM 3000介导外源DNA转染梅花鹿耳成纤维细胞,探讨质粒DNA与脂质体比例（1.0∶1.0,1.0∶1.5,1.0∶2.0,1.0∶2.5,1.0∶3.0）、质粒用量（0.5,1.0,1.5,2.0,2.5μg）、细胞传代次数（第2～6代）、细胞初始接种密度（50%,60%,70%,80%,90%）、转染效果观测时间（12,24,36,48,60 h）对转染效率的影响。结果表明：组织块贴壁法培养的梅花鹿耳成纤维细胞在倒置荧光显微镜下可见长梭形细胞生长,细胞免疫荧光检测波形蛋白（Vimentin）的表达结果为阳性;筛选的最佳转染条件：当质粒DNA与脂质体比例为1.0∶2.0,质粒DNA用量为1.5μg,细胞传代次数为第3代,细胞初...     

FAM213B基因启动子在猪子宫内膜细胞的转录调控

【目的】分析猪FAM213B基因启动子转录活性区域,并检测转录因子NFκB对启动子活性及猪FAM213B基因表达影响,为深入了解FAM213B基因的转录调控机制影响前列腺素合成、母猪妊娠等繁殖活动奠定基础。【方法】采集卵泡期子宫,分离子宫内膜上皮组织,经胶原酶方法获得猪原代子宫内膜细胞,用于猪FAM213B基因启动子活性检测。参照笔者所在课题组前期研究获得的猪FAM213B基因m RNA全序列(Gen Bank登录号:KX444503)以及5￠调控区序列(Gen Bank登录号:100134955),通过PCR扩增猪FAM213B基因较长启动子序列,并进行测序鉴定;在此基础上,PCR扩增带有Mlu I和Xho I限制性酶切位点的FAM213B基因启动子7个5'端缺失片段,并通过双荧光素酶报告基因载体系统构建猪FAM213B基因启动子7个不同的5'端缺失载体。将7个载体经无内毒素处理后与p RL-TK质粒用阳离子脂质体法一起转染猪子宫内膜细胞,用双荧光素酶报告基因系统进行Luciferase活性检测,比较各启动子片段转录活性。生物信息学分析FAM213B基因启动子潜在转录因子结合位点,通过Ch IP试验验证FAM213B基因启动子与潜在转录因子NFκB的相互作用。构建NFκB1和Rel A的超表达载体,化学合成NFκB1和Rel A的干扰si RNA片段,分别转染猪子宫内膜细胞,通过双荧光素酶报告基因系统进行Luciferase活性检测和荧光定量PCR分别检测超表达和干扰表达NFκB1和Rel A对猪FAM213B基因启动子活性和m RNA表达影响。【结果】PCR和测序获得猪FAM213B基因启动子长度为2 261bp(-2178/+83)。生物信息学预测结果表明猪FAM213B基因启动子区存在潜在的CREB、CCAAT增强子结合蛋白、E-box因子的结合位点,炎性因子NFκB潜在结合位点分别位于-1143/-1132和-664/-655区间。启动子报告基因活性检测结果表明:重组载体P2(-1352/+30)荧光活性最高,极显著高于P1(-1 760/+30)(P0.01),在-1 760/-1 352区域存在负调控元件;而P2显著高于P3(-919/+30)(P0.05),表明在-1352/-919区域存在正调控元件;P3(-919/+30)活性极显著高于P4(-604/+80)(P0.01),表明在-919/-604区域存在正调控元件;P4、P5、P6和P7活性差异不显著,-1352/-919区域为核心启动子区,-1352/-604对于维持该启动子较高转录活性起着重要的作用。Ch IP结果表明启动子区-1143/-1132存在NFκB1结合位点,-664/-655存在Rel A结合位点。超表达载体pc DNA3.1-NFκB1与P2(-1352/+30)启动子片段重组载体共转染猪子宫内膜细胞后,P2启动子活性极显著高于对照组(P0.01),pc DNA3.1-NFκB1载体单独转染猪子宫内膜细胞后FAM213B基因m RNA表达量显著高于对照组(P0.05);超表达载体pc DNA3.1-Rel A与P3(-919/+30)启动子片段重组体共转染猪子宫内膜细胞,P3启动子活性极显著低于对照组(P0.05),pc DNA3.1-Rel A载体单独转染猪子宫内膜细胞后,FAM213B基因的mRNA表达量显著低于对照组。转染NFκB1和Rel A的si RNA片段干扰片段,FAM213B基因启动子活性和m RNA表达量则表现与超表达相反的结果。【结论】获得了猪FAM213B基因启动子核心启动子序列为-1352/-919区域,NFκB是FAM213B基因启动子的转录因子,NFκB成员NFκB1和Rel A在猪子宫内膜细胞中对FAM213B基因的表达起调控作用。     

piggyBac转座子介导的牛A-FABP表达载体的构建与鉴定

【目的】构建以piggyBac(PB)转座子为载体元件,绿色荧光蛋白(EGFP)为报告基因,Neomycin(NEO)为抗性基因,alpha-肌动蛋白(α-actin)为启动子的A-FABP基因特异性表达载体pPB-AFABP,并验证其转座活性。【方法】通过PCR方法合成PB转座子骨架序列、NEO-EGFP、α-actin启动子以及A-FABP基因序列,并将各个序列连接构建成转基因载体pPB-AFABP;用脂质体法将供体质粒pPB-AFABP和辅助质粒pCAG-PBase组成的PB二元系统及质粒pPB-AFABP分别转染牛成纤维细胞,通过G418筛选得到转基因细胞。【结果】经过酶切和测序鉴定,载体pPB-AFABP构建正确;PB二元系统的阳性克隆数明显多于转座子载体pPB-AFABP的克隆数;PCR鉴定结果表明,牛成纤维细胞中存在目的基因A-FABP。【结论】成功构建了转基因表达载体pPB-AFABP,且证实PB转座子在牛成纤维细胞中具有较高的转座活性。     

鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至 7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含"GC"碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

牛FADD基因过表达和RNAi载体构建及在牛胎儿成纤维细胞中的表达

FADD(Fas-associated death domain protein)存在于Fas/FasL系统中,是信号传导通路的一个信号连接蛋白,FADD通过传递凋亡信号,从而介导细胞凋亡。为进一步验证FADD基因抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用,从牛卵巢组织中扩增FADD基因,将FADD基因连接到带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pAcGFP-N1中,构建过表达FADD基因载体,并构建FADD基因的RNAi载体;用脂质体介导法将FADD基因RNAi载体、真核表达载体转染到牛胎儿成纤维细胞中,观察有无荧光的表达,并使用Real-Time qPCR和Western blot方法检测FADD基因mRNA、蛋白水平的表达情况。结果表明:成功构建出FADD基因RNAi载体和高表达载体,重组质粒转染牛胎儿成纤维细胞24 h后在荧光显微镜下可观察到绿色荧光,转染效率可达50%。     

鸡局部黏着斑激酶基因5′UTR及启动子的克隆鉴定

为了研究鸡局部黏着斑激酶(FAK)基因表达调控的分子机制,运用cDNA末端快速扩增技术确定了鸡胚成纤维细胞FAK基因的转录起始位点,并发现FAK基因mRNA的5′非翻译区(5′UTR)存在4种剪切形式.分析这4种剪切形式的5′端序列,发现它们都不影响蛋白的编码,但可能影响mRNA的翻译效率.另外,将启动子序列935 bp片段克隆构建到荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic中,转染鸡胚成纤维细胞,测定启动子的转录活性.通过启动子序列系列缩短的克隆,将核心启动子区定位在转录起始位点上游-662至+7的669 bp片段内,该启动子的典型特征是:没有TATA盒,而富含“GC“碱基.以上结果为FAK基因的表达调控研究提供了分子基础.     

猪TCAP基因转录因子的筛选与鉴定

克隆了猪TCAP基因1 662 bp的启动子序列,序列分析发现其启动子区域存在Myo D、Myo G、MEF2转录因子结合位点,并构建了3个转录因子超表达载体,分别与TCAP基因启动子载体共转染PK细胞。结果表明,3个转录因子使TCAP基因启动子活性升高,均正调控TCAP基因的表达。     

禽U6启动子的克隆、序列分析及其驱动的siRNA表达

 【目的】分离用于禽源细胞中表达短干扰RNA（short interference RNA,siRNA）的禽U6启动子。【方法】以鸡基因组为模板进行PCR扩增,将扩增产物进行序列测定和生物信息学分析,并将其插入报告基因载体pEGFP-N1中,获得siRNA表达载体pGFP-U6,将由软件预测针对GFP基因的siRNA所对应的shRNA（short hairpin RNA）插入其中,获得pGFP-U6-shRNA;以含人H1启动子的siRNA表达载体pGFP-H1-shRNA为对照,分别转染COS-1和DF-1细胞,用荧光显微镜和流式细胞仪测定转染细胞培养中GFP阳性细胞数和荧光总量。【结果】克隆的U6启动子位于鸡28号染色体,与发表的鸡U6-3启动子同源性为97.2%,含多个Oct-1序列,不含CACCC框、SPH和PSE等聚合酶Ⅲ启动子序列,TA框不典型;在pGFP-U6-shRNA转染的哺乳动物源COS-1细胞培养中,GFP阳性细胞数和荧光总量均有所下降,但不如pGFP-H1-shRNA转染细胞显著;在pGFP-U6-shRNA转染的禽源DF-1细胞培养中,不仅GFP阳性细胞数和荧光总量显著下降,而且基因沉默效果显著优于pGFP-H1-shRNA转染细胞。【结论】成功克隆的禽U6启动子不仅能有效转录siRNA,而且转录活性具有相对的细胞种属特异性。     

奶牛SREBP1蛋白在乳腺上皮细胞的表达定位及对SCD1基因启动子的转录调控

【目的】固醇调节元件结合蛋白1(SREBP1)作为核转录因子,对于细胞脂肪合成酶基因的表达发挥着重要的调控作用。论文旨在奶牛乳腺上皮细胞中研究SREBP1对于SCD1基因启动子的转录调控作用,为进一步明确SREBP1对于靶基因的转录调控机制提供理论基础。【方法】以荷斯坦奶牛乳腺组织的c DNA为模板,采用分段克隆的方法获得SREBP1基因的编码序列,通过重组酶与pc DNA3.1载体进行重组环化构建pc DNA3.1-SREBP1表达载体,将构建的载体测序验证后提取质粒,转染奶牛乳腺上皮细胞。以EIF3K基因为内参基因,采用荧光定量PCR检测SREBP1基因m RNA的表达差异;采用免疫荧光的方法对SREBP1进行标记,以DAPI复染细胞核,激光共聚焦观察SREBP1蛋白的亚细胞定位;转染含有不同调控元件的SCD基因启动子,同时转染1.0μg pc DNA3.1-SREBP1作为处理,荧光素酶报告基因系统分析启动子活性;分别转染0.25、0.5和1μg的pc DNA3.1-SREBP1载体,分析p GL3-SCD 2和p GL3-SCD3启动子活性与SREBP1之间的量效关系。【结果】分段克隆得到的PCR产物分别为1 170、1 116、363和900 bp的片段,经过与pc DNA3.1载体重组后获得pc DNA3.1-SREBP1表达载体,经酶切和测序验证,发现除1个无义突变外,与标准序列完全相同,整个序列长度达到3 510bp;将pc DNA3.1-SREBP1载体转染乳腺上皮细胞后,Real-time PCR检测发现与转染空载体的对照组相比,SREBP1基因的m RNA表达倍数增强130.4倍(P0.001);激光共聚焦观察发现,DAPI染色的细胞核呈蓝色,免疫荧光标记的SREBP1呈绿色,二者融合后呈现青色,共定位在乳腺上皮细胞核中;启动子活性检测发现,与p GL3-SCD1、p GL3SCD 2相比,SREBP1处理能够极显著增加p GL3-SCD3、p GL3-CD4启动子的活性(P0.001),分别比对照组提高了1.0倍和0.7倍,进一步分析发现,在用0.25—1μg的pc DNA3.1-SREBP1处理后,与p GL3-SCD2的启动子活性持续下降相比,p GL3-SCD3的启动子活性从59.81上升到108.43(P0.001),二者存在剂量效应关系,结合SCD2和SCD 3启动子上主要的结构差异SRE元件(5′-AGCAGATTGCG-3′),推测此序列可能是SREBP1调控SCD基因启动子转录的结合序列。【结论】克隆构建奶牛SREBP1基因表达载体,亚细胞定位SREBP1蛋白主要在乳腺上皮细胞核中,SREBP1可以与SRE调控元件结合促进SCD1基因启动子的转录。     

猪胎儿成纤维细胞的分离与基因转染

为利用核移植法获取转基因克隆猪提供供体细胞,体外分离培养猪胎儿成纤维细胞并进行了绿色荧光蛋白基因转染。首先采用组织块贴壁法分离培养猪胎儿成纤维细胞,绿色荧光蛋白表达载体以脂质法介导转染猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选获得稳定转染的细胞克隆,PCR鉴定外源基因在细胞基因组中的整合,利用荧光显微镜检测荧光蛋白的表达。结果表明,组织块贴壁后9 d可获取原代成纤维细胞,基因转染后利用G418筛选9 d即可获得转基因细胞,对转基因细胞进行传代,PCR检测显示荧光蛋白基因整合到细胞基因组中,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白表达,为下一步通过核移植方法获得转基因猪提供了基础。