山东省肉种鸡群三种家禽肿瘤性疾病流行病学调查

为调查山东省家禽肿瘤性疾病的流行情况,本研究以血清学、病理组织学、免疫组织化学、病原学等检测手段,在山东省境内17家AA种鸡场进行检测.血清学试验结果显示:马立克氏病病毒(MDV)平均抗原阳性率为1.87%;禽白血病病毒J亚群(ALV-J)和网状内皮组织增生症病毒(REV)平均抗体阳性率分别为9.52%和39.78%;双重及三重感染,MDV+ALV-J、MDV+REV、ALV-J+REV及MDV+ALV-J+REV感染率分别为1.12%、1.21%、3.92%和0.65%.对57羽疑似肿瘤病的病鸡检测显示:MDV、ALV-J和REV的抗体阳性率分别为19.3%、47.37%和57.89%;MDV+ALV-J、MDV+REV和ALV-J+REV的双阳性率分别为1.75%、3.5%和19.3%;无三重感染.病理组织学观察显示:病鸡体内既有各病毒引起的单纯肿瘤,也有双重肿瘤共存的现象.免疫组织化学检测显示,MDV、ALV-J和REV抗原阳性信号在病鸡中的比例分别为38.6%、54.39%和28.07%.PCR检测结果表明:MDV、ALV-J和REV的阳性率分别为43.86%、64.91%和33.33%;MDV+ALV-J、MDV+REV、ALV-J+REV和MDV+ALV-J+REV阳性率分别为15.79%、10.53%、12.28%和7.02%.本研究结果表明,山东省境内AA肉鸡群中仍存在较高的肿瘤性病毒感染率.     

麻黄鸡ALV-J、FAdV-4、FWPV混合感染的诊断

为了确定贵州省某规模养殖场病鸡发病的原因,本试验对发病鸡进行了临床剖检,取其鸡冠、肝脏、心脏、脾脏和肾脏等病料组织进行了细菌分离培养,并进行了鸡痘病毒(FWPV)、J亚型禽白血病病毒(ALV-J)和血清4型禽腺病毒(FAdV-4)的PCR检测。结果显示：实验室剖检可见病鸡存在鸡冠痘状结痂、肝脏肿瘤结节、心包积液、脾脏肿大等症状;细菌分离培养无菌落形成;基于ALV-J gp85、FAdV-4 penton、FWPV TK基因片段的PCR检测均呈阳性;随后的ALV-J gp85、FAdV-4 penton、FWPV TK基因克隆及序列分析进一步揭示了3种病毒的遗传进化状况。因此,送检病鸡确诊为ALV-J、FAdV-4、FWPV混合感染,依据确诊结果向有关养殖场提出了合理的防治措施建议。     

散养土鸡J亚群禽白血病病毒和网状内皮组织增生症病毒混合感染的诊断

湖北某农户散养的土鸡,鸡群精神委靡、整体消瘦,对病鸡进行剖检,发现部分鸡体表和脏器可见大小不等的肿瘤结节。取病变典型的组织制作病理切片,镜检可看到髓样细胞瘤和网状细胞。提取病鸡组织DNA,用两组Multi-PCR分别检测A、B、J亚群禽白血病病毒(ALV-A、ALV-B、ALV-J)和马立克病病毒(MDV)、禽网状内皮增生症病毒(REV)。结果仅扩增出与ALV-J和REV相应的条带,表明该鸡群为ALV-J和REV混合感染。     

黄羽父母代种鸡混合感染禽白血病病毒与马立克病病毒的鉴定

广西某养殖场130日龄父母代种鸡发生临床肿瘤样病变和死亡,对病鸡采用病理解剖、组织病理学观察、PCR检测、病毒分离以及分离株重要基因的序列测定和病原鉴定。结果显示:病鸡的心脏、肝脏、脾脏等部位表现有肿瘤样病变; PCR检测及病毒分离培养有J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus subgroup J,ALV-J)和马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)的感染; ALV-J分离株env基因的序列与10株ALV-J参考株的核苷酸相似性为87. 2%～97. 7%,与ALV A-E亚型参考株的相似性为53. 5%～54. 7%;与ALV-J英国原型株HPRS-103的env基因糖基化位点进行分析比较,部分糖基化位点发生了改变; MDV分离株meq基因序列与8株MDV参考株的核苷酸相似性为98. 7%～99. 4%,分离株在第71～80位氨基酸发生突变,符合国内强毒分离株的特征。结果说明:该鸡群为ALV-J和MDV的混合感染。     

鸡J亚群禽白血病病毒与七种常见病毒混合感染的调查

应用PCR方法对2009年6月到2009年9月来自不同地区、不同品种、不同日龄的45个疑似感染J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的病鸡病料进行检测,同时对ALV-J与新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性法氏囊病病毒(IBDV)、H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 AIV)、包涵体肝炎病毒(IB-HV)、鸡传染性贫血病毒(CIAV)和呼肠病毒(REOV)等病毒的混合感染情况进行了调查。结果表明,采用ALV-J的特异性引物H5/H7,在45份送检病料中,有3份检出ALV-J,阳性率为6.67%。绝大多数病例检测出内源性禽白血病病毒,部分病例检测有其他7种病毒中的一种或几种。混合感染病例中以IBHV和IBV混合感染的比率较高,其中ALV-J与H9N2亚型AIV混合感染多见。     

三黄鸡临床多发性肿瘤相关的J亚群禽白血病病毒的分离鉴定及其病理学观察

为研究蛋鸡多发性肿瘤的病因,本实验对病鸡肿瘤组织进行病毒分离、培养及PCR检测,均扩增出针对J亚群禽白血病病毒(ALV-J)gp85基因序列的阳性条带;组织病理学观察显示发病鸡呈现髓细胞瘤、血管瘤以及纤维肉瘤等多发性肿瘤的病理变化;肿瘤细胞通过血液转移、浸润,在肝和脾组织形成局灶性或弥漫性肿瘤病灶。免疫组化染色显示肿瘤组织内,部分肿瘤细胞呈现阳性反应,表明只有部分肿瘤细胞存在ALV-J感染,而大部分肿瘤细胞检测结果呈阴性。这些病毒检测为阴性的肿瘤细胞可能是正常细胞转化为肿瘤细胞大量克隆化增殖的结果。     

表现腺胃炎的蛋用型鸡J亚群-白血病病毒的分离与鉴定

从表现腺胃炎的尼克珊瑚粉商品代蛋鸡中分离到J亚群-白血病病毒(ALV-J)。将病料或鸡白细胞接种于CEF,培养12 d,分别采用单克隆抗体间接免疫荧光试验检测,结果10只鸡中有9只鸡分离到ALV-J,其中有4只鸡还存在与禽网状内皮增生病病毒(REV)的共感染。通过PCR扩增gp85基因,与已发表的20株ALV-J进行同源性比较。结果表明,与来自白羽肉鸡的HPRS103的同源性为97.8%,而与来自蛋用型鸡的SD07LK1株的同源性为93.0%。本研究发现,在某些仅仅发生腺胃炎的鸡也可能普遍存在ALV-J感染,再次显示了腺胃炎病料中病毒感染的多样性。ALV-J可能成为致腺胃炎的病原之一,但其致病作用有待进一步研究。     

ALV-J感染对鸡脾脏巨噬细胞天然免疫因子的影响

为探究J亚群禽白血病病毒（Avian leukosis virus subgroup J,ALV-J）对鸡脾脏巨噬细胞天然免疫反应的影响,试验利用密度梯度离心法和贴壁法,从鸡脾脏组织中分离得到单核细胞,并通过显微镜观察培养至24 h、72 h、120 h单核细胞的分化过程;通过PCR扩增ALV-J特异性引物H5/H7,验证脾脏巨噬细胞对ALV-J的易感情况;同时,通过qPCR验证感染ALV-J后鸡原代脾脏巨噬细胞中炎性因子、干扰素及肿瘤抑制因子的表达。结果显示：单核细胞分化至第120 h形成形态正常的巨噬细胞,通过流式细胞技术检测鸡巨噬细胞表面特异性标记蛋白发现,84.9%的细胞为KUL01阳性细胞;鸡原代脾脏巨噬细胞对ALV-J易感,并且ALV-J可整合进鸡原代脾脏巨噬细胞基因组中;对感染ALV-J的鸡脾脏巨噬细胞进行形态观察,发现ALV-J感染导致鸡脾脏巨噬细胞形态逐渐萎缩直至死亡;ALV-J感染6 h、12 h、24 h及48 h可诱导鸡原代脾脏巨噬细胞炎性因子（IL-1β、IL-6）的表达显著上调,在ALV-J感染24 h、48 h诱导肿瘤抑制因子（TNF-α）的表达显著上调（...     

地方品种JS鸡多发肿瘤病的病原学分析

为探究江苏地方品种JS鸡种易发肿瘤病的原因,本研究从病原学方面进行相关分析。通过剖检发现JS鸡疑似发生肿瘤病;观察组织切片发现禽白血病病毒(ALV)、马立克病毒(MDV)引起其的特征性病变;分别应用2对可区分MDV野毒和疫苗毒的鉴别引物、1对ALV群特异性引物、5对可区分不同亚型ALV的鉴别引物,以及3对网状内皮组织增生症病毒(REV)特异性引物对病料样品和细胞培养物进行PCR检测;同时,采用间接免疫荧光试验(IFA)检测培养细胞中的禽REV,ELISA检测细胞上清中ALV-p27抗原。检测结果显示,鉴定出的MDV为血清1型MDV野毒,ALV为J亚型(ALV-J),REV为阴性。采集同群发病鸡血液分离MDV、ALV-J,将获得的病毒株人工接种1日龄SPF鸡,感染后5 d自实验鸡血液中分离到MDV、ALV-J,表明该分离株可感染SPF鸡,具有良好的生物学活性。本研究从JS品种鸡中检测到了致瘤性病毒MDV和ALV-J,这可能是该品种鸡肿瘤病多发的主要原因之一,这一研究结果对JS鸡肿瘤病的防制提供了科学依据。     

禽J亚群白血病的PCR鉴定与病理学分析

对山东济南某蛋鸡养殖场送检的5只发病鸡,通过PCR方法进行实验室诊断并进行病理组织学分析。结果发现,病鸡肝、脾、肾等组织器官显著肿大并有灰白色肿瘤结节,瘤细胞为髓样细胞;取病死鸡的肝脏、肺脏提取DNA样本,从中扩增出ALV-J亚群特异性的病毒核酸。上述检测结果判定该病例为髓细胞瘤型禽J亚型白血病。取病鸡内脏器官进行常规石蜡切片,HE染色,镜下观察发现肿瘤组织主要由髓样瘤细胞组成,心、肾、肝等可见髓样瘤细胞浸润。     

淋巴细胞性J亚群禽白血病病理学观察

本研究旨在探讨日益复杂和多样的J亚群禽白血病的肿瘤病理表现.在流行病学调查基础上,对广东省4个集约型清远麻鸡种鸡场的禽白血病病原进行了分离鉴定和PCR检测,确诊其病原为禽白血病毒J亚群(ALV-J).通过病理组织学研究发现,这些鸡场ALV-J的主要病理表现为淋巴细胞性肿瘤(82.9％),其次为血管瘤型肿瘤(11.4％),髓细胞性肿瘤仅为5.7％.淋巴细胞性肿瘤主要出现在内脏实质器官,肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、腺胃和胰腺等器官明显肿胀,实质中可见大小不一的灰白色肿瘤结节,切面均质柔软.肿瘤的实质主要由典型的成淋巴细胞和淋巴样瘤细胞构成,病理性核分裂像多见.研究结果证实,清远麻鸡出现了一种新的J亚群禽白血病表现形式,即淋巴细胞性J亚群禽白血病,在国内外尚属首次报道.     

用ALV-J gp85单克隆抗体证明蛋鸡存在J亚群禽白血病

采用免疫组化法，对病理学初步诊断为蛋用型鸡J亚群白血病的自然发病鸡的肿瘤、骨髓、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、心脏、胰脏、输卵管、卵巢、腺胃、骨骼肌、大脑、坐骨神经，用特异性抗J亚群禽白血病病毒(ALV—J)囊膜糖蛋白gp85的单克隆抗体进行检测，待检的组织切片中均检出阳性抗原，免疫组化的研究结果与病理学诊断结果相一致。在国内外首次发现并报道蛋用型鸡J亚群禽白血病的自然病例。     

禽白血病病毒J亚群自然感染商品蛋鸡致瘤性新特征

2009年8月,山东省邹城市某海兰褐蛋鸡群,160日龄发病,死亡率为7％.患鸡经大体剖检、病理组织学、PCR和免疫组织化学等检测,确诊为禽白血病病毒J亚群(ALV-J)感染.病理组织学检测发现,病鸡单独患血管瘤,或髓细胞瘤和纤维肉瘤多发性出现,由ALV-J自然感染引起同一鸡体出现髓细胞瘤和纤维肉瘤尚属国内外首次报道.肝脏研磨接种DF-1细胞培养7d后传3代,细胞无病变,ELISA检测感染细胞上清ALV p27抗原阳性,进一步确诊此鸡群为ALV感染.对病变严重的鸡进行病毒分离及ALV-J gp85基因同源性比较显示与原型株HPRS-103的同源性最高,达94.1％.本研究丰富了ALV-J感染的临床诊断依据,并为ALV-J在我国蛋鸡群中多潜能致瘤机制的研究提供了科学基础.     

某海兰褐鸡场祖代、父母代及商品代鸡血管瘤型ALV-J的分离与鉴定

从山东省某海兰褐鸡场祖代、父母代种鸡和商品代蛋鸡中获得疑似血管瘤型禽白血病(Avian leukosis,AL)病料.采用病理剖检、IFA、分子生物学检测,确定为J亚群禽白血病.从祖代、父母代病料中各分离到1株J亚群禽白血病病毒(J subgroup of avian leukosis virus,ALV-J),从商品代蛋鸡中分离到4株ALV-J.根据原型毒株HPRS103设计1对gp85基因引物,获得gp85基因序列.获得的gp85基因序列与各亚群参考毒株序列核苷酸同源性比对,结果显示:分离自商品代蛋鸡的Commercial03株、Commercial04株、Commercial06株和父母代分离株Parent02株位于同一分支,同源性在97.2％～97.9％,与HPRS103株同源性94.7％～95.2％;Commercial05株与祖代分离株Grandparent01株在同一分支,与HPRS103株同源性为98.3％,4株分离自商品代的ALV-J同源性为95.0％～99.9％.表明商品代蛋鸡中的ALV-J可能来自父母代或祖代种鸡的垂直传播,也可能来自于其他来源的水平传播.从同一鸡场祖代、父母代及商品代鸡中分离得到ALV-J,这在我国还是首次.对后续研究其基因突变、致瘤机制等奠定了良好的基础.     

Avian leukosis subgroup J in broiler breeders in Switzerland

Since a new envelope subgroup (J) of the avian leukosis-sarcomatosis-complex was isolated for the first time from broiler breeders in the United Kingdom in 1989 and was characterized and associated with myeloid leukosis (syn. myelocytomatosis) the emergence of this subgroup was reported from all over the world. Thus the first known case of subgroup J avian leukosis in Switzerland in four imported broiler breeder flocks will be described. A total of 53 broiler breeder birds from four flocks showing reduced performance and increased mortality were submitted for postmortem examination. Approximately 20 blood samples from each flock were monitored serologically for antibodies against avian leukosis virus subgroup J (ALV-J). On necropsy myeloid leukosis (ML) was diagnosed in all four flocks. Furthermore the blood samples of three flocks showed significant ELISA-titres for ALV-J.     

商品蛋鸡成髓细胞瘤、血管瘤型J亚群白血病病毒特性的研究

2007年7月山东某蛋鸡场150日龄海兰褐蛋鸡发病,前期经病理学和免疫组织化学检测证明和ALV—J密切相关。取4只病鸡的肝组织处理后接种鸡胚成纤维细胞（CEF）培养,用ALV—J单抗G2-3进行间接免疫荧光检测,结果呈现强阳性,将反应为阳性的4株病毒分别命名为WS0701、WS0702、WS0703和WS0704;根据ALV-J原型株HPRS-103的序列设计1对针对外源性ALV—J的引物P1和P2,提取阳性CEF基因组DNA作为模板,PCR扩增后,得到长度为924bp的片段;PCR扩增产物测序结果显示,与HPRS-103的同源性为95．0％～97．5％,与国内分离株的同源性为92．0％～95．9％;遗传变异分析结果表明成髓细胞瘤型、血管瘤型ALV-J与国内毒株的同源性较远,而与HPRS-103的同源性最近,这说明ALV—J在蛋鸡体内复制的过程中有返祖现象,并呈现了新的肿瘤学特征。     

J 亚群禽白血病病毒gp85单抗1E3株抗原识别表位的初步分析

J 亚型禽白血病是由 J 亚群禽白血病病毒引起的一种以成髓细胞增生、免疫抑制、生长发育受阻为特点的传染性肿瘤疾病,于1988年首次发现,其病毒囊膜表面蛋白gp85决定了病毒亚群特异性.本试验将原核表达质粒pET-28a-J gp85中的gp85基因分段亚克隆至重组表达质粒pGEX-6p-1上并在大肠杆菌中成功地表达,用ALV-J Sl gp85单克隆抗体1E3株对分段表达的gp85蛋白进行初步的免疫印迹分析.结果表明:ALV-J Sl gp85单抗1E3株所识别的抗原表位位于蛋白N端的第69至112个氨基酸之间.这将为ALV-J gp85抗原决定簇所在位点及其免疫学功能的研究奠定基础.     

二甲双胍对鸡巨噬细胞HD11天然免疫相关基因表达影响及其抗禽白血病病毒能力分析

本研究旨在探讨二甲双胍(metformin)处理对鸡巨噬细胞HD11天然免疫相关基因表达及禽白血病病毒(Avian leukosisvirus,ALV)复制水平的影响。用2mmol/L二甲双胍处理鸡巨噬细胞HD11,处理48h后收集细胞,荧光定量PCR(RT-qPCR)检测天然免疫基因和内源性反转录病毒的表达。另外,将J亚群禽白血病病毒(J subgroup Avian leukosis virus,ALV-J)(MOI=5)接种于细胞板中,病毒感染细胞24 h后进行二甲双胍处理, 48 h后收集HD11细胞和上清分别进行RT-qPCR检测和ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)检测。结果表明,二甲双胍显著上调HD11细胞天然免疫相关基因TLR3(P<0.01)、IFIH1(P<0.01)、IRF7(P<0.01)、STAT1(P<0.05)、IFN-α(P<0.01)、IFN-β(P<0.01)表达水平,并激活了鸡内源性反转录病毒的表达,抑制ALV-J复制水平。综上,二甲双胍可激活鸡巨噬细胞的天然免疫反应,从而提高鸡抗禽白血病病毒的能力。本研究在体外实验中验证二甲双胍具有抑制ALV增殖的作用,对家禽业的疾病防控有一定的应用价值。     

J亚群禽白血病ELISA抗体检测方法的建立

本研究分离纯化了具有反应活性的J亚群禽白血病JL-2株gp85表达蛋白,并以其为抗原,开展了相关反应条件、特异性、重复性、敏感性、现地应用以及国外试剂盒符合率等方面的研究,初步建立了J亚群禽白血病ELISA诊断方法.     

Heterophil function and resistance to staphylococcal challenge in broiler chickens naturally infected with avian leukosis virus subgroup J

Avian leukosis virus subgroup J has a high tropism for myeloid lineage cells and frequently induces neoplastic transformation of myelocytes. The impact of congenital avian leukosis virus subgroup J infection on the function of circulating heterophils and susceptibility to staphylococcal infection was investigated. Six-week-old broiler chickens negative for exogenous avian leukosis viruses or congenitally infected with avian leukosis virus subgroup J were inoculated intravenously with 10(6) colony-forming units of Staphylococcus aureus, and pre- and postinoculation heterophil function was assessed. All chickens developed a leukocytosis with heterophilia after inoculation, but total leukocyte and heterophil counts were significantly higher in leukosis-negative chickens than in virus-infected chickens. Tenosynovitis was more severe in leukosis-negative chickens, and 2/10 (20%) of the virus-infected chickens had no histologic evidence of tenosynovitis. Osteomyelitis in the tibiotarsus or tarsometatarsus developed in 5/10 (50%) of the chickens in each group. S. aureus was recovered from the hock joint of 6/10 (60%) of the chickens in each group. Heterophils from all chickens exhibited similar phagocytic ability pre- and postinoculation. Heterophils from virus-infected chickens exhibited less bactericidal ability preinoculation than did heterophils from leukosis-negative chickens. However, postinoculation bactericidal ability was similar in both groups. Avian leukosis virus subgroup J provirus was present in heterophils isolated from congenitally infected chickens. Heterophils isolated from broiler chickens congenitally infected with avian leukosis virus subgroup J exhibit no significant functional deficits, and infected and uninfected chickens exhibit similar susceptibility to staphylococcal infection.