鸽源新城疫病毒陕西分离株P基因的克隆及序列分析

【目的】对鸽源新城疫病毒(NDV)陕西分离株P基因进行克隆和序列分析,为研究P基因及V基因的功能奠定基础,并为防治新城疫提供科学依据。【方法】参考GenBank发表的NDV基因序列设计1对特异性引物,RT-PCR扩增NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因的全长片段,并进行克隆、序列测定和分析。【结果】NDV/Pigeon/ShX/China/2003P基因全长1 451 bp,其完整的ORF长度为1 188 bp,编码395个氨基酸。同源性比较可知,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与其他分离株P基因的核苷酸序列同源性在63.6%~92.9%,推导的氨基酸序列同源性在67.7%~92.2%。系统发育进化树表明,NDV/Pigeon/ShX/China/2003与鸽源分离株P68亲缘关系最近,与F48E9和La Sota毒株处于进化树的不同分支。【结论】NDV/Pigeon/ShX/China/2003与国内外已报道的NDV毒株间存在较大变异。     

鸡新城疫病毒分离株F基因的分子特性分析

【目的】对新城疫病毒(NDV)分离毒株进行分子特征分析,了解免疫鸡群发生新城疫的原因。【方法】用非免疫鸡胚从病鸡肺脏中分离新城疫病毒;参考GenBank上发表的NDV的F基因序列设计引物,应用RT-PCR方法对新城疫病毒分离株进行扩增,并构建克隆载体,对阳性质粒测序后进行F基因核苷酸及推导氨基酸序列分析。【结果】从发病鸡群中分离到6株NDV,分离毒株间的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸同源性分别在99.6%~99.9%和99.1%~99.8%;分离毒株与参考毒株的F基因核苷酸和F蛋白氨基酸序列同源性分别在83.2%~87.3%和90.2%~93.8%;分离毒株F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的分子特征;6个分离株均属NDV基因Ⅶ型。【结论】NDV分离株的F基因已经发生明显变异,与La Sota、Clone-30、V4等常用疫苗株在遗传进化上的亲缘关系较远,这可能是免疫鸡群发生新城疫的重要原因之一。     

不同来源的5株新城疫病毒的分离·鉴定与基因型分析

[目的]分离鉴定不同来源的5株新城疫病毒（NDV）,并对其基因型进行分析。[方法]从江苏和广西发病孔雀、鸡、鹅群分离到5株NDV。参照文献合成1对引物P1和P2,用于扩增基质蛋白基因（M）1161nt至融合蛋白基因（F）889nt之间长约970nt的片段。用TrizolRNA试剂盒抽提5株NDV基因组,再按照Promega说明书,用上游引物P1合成F基因cDNA,合成的cDNA作为聚合酶链式反应（PCR）的扩增模板,用PCR反应扩增F基因目的片段。将所得产物进行序列测定,获得这5株NDVF基因5′端约890nt序列。采用DNAMAN软件对F基因47～420nt间的片段进行序列分析,并推导出相应的氨基酸序列。在此基础上,从GenBank中选取32个参考毒株与这5个分离株进行遗传变异分析,并绘制系统发育进化树。[结果]同源性分析比较表明,5株NDV分离株之间的差异性很小,它们之间的同源性为95.00%～97.00%,其中2株广西分离株之间的同源性为97.07%,3株鹅源分离株之间的同源性为96.43%。所有毒株F蛋白裂解区氨基酸序列均为112R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株裂解区位点特征。这5株NDV分离株均属于基因Ⅶ型和Ⅶd亚型。[结论]近几年流行的NDV的主导基因型为基因Ⅶ型,且来自不同宿主的毒株之间的差异性较小。     

新城疫病毒山东分离株F和HN基因克隆与进化分析

选取山东2007 ～ 2008年的5株NDV流行株,克隆融合蛋白(F)和血凝素-神经氨酸酶(HN)基因全长并测序.结果表明,5个分离株F基因长度为1662 bp,编码553个氨基酸.F蛋白裂解位点的氨基酸序列均为112 R-R-Q-K-R-F117,符合强毒株F基因裂解位点的氨基酸序列特征.对F基因47 ～420 nt序列进行比对,发现4株鸡源毒株基因型为Ⅶd,另一鸽源毒株基因型为Ⅵ.5个分离株间F基因核苷酸和氨基酸序列同源性分别为88.8％～99.7％和94％～99.3％,与LaSota、Clone30、F48E9的氨基酸同源性分别为88.4％～89.5％、87.7％～88.8％、90.8％～92.4％.HN基因长度为1801bp,编码571个氨基酸,5个毒株均含13个半胱氨酸残基且位置保守.与LaSota的氨基酸同源性为87.2％～88.8％,与8个山东NDV流行株的同源性为89.8％～98.6 ％.     

信鸽新城疫病毒P/Anhui/1/09株囊膜糖蛋白基因的 遗传进化及氨基酸差异性位点分析

为分析流行于信鸽群中新城疫病毒致病株P/Anhui/1/09的分子遗传特性及其囊膜糖蛋白的差异性,采用RT-PCR法扩增其F和HN基因开放阅读框(ORF),并与已公布的主要代表性毒株序列进行遗传进化分析及615个全长F基因和480个全长HN基因推导氨基酸序列比对分析,同时对P/Anhui/1/09株进行型内遗传关系分析。结果显示:P/Anhui/1/09株F和HN基因开放阅读框长度分别为1 662 bp和1 716 bp,GenBank登录号分别为JQ290284和JQ305097,其F基因与NDV05-029、PG/CH/JS/1/06、CH/98-1鸽源毒株亲缘关系最近,同源率在98.2%～99.5%,同属基因VIb亚型,但与传统疫苗株LaSota、V4、B1和Mukteswar的遗传距离较远,同源率仅在84%～86.3%。HN基因ORF进化树分支拓扑结构与F基因相似。型内遗传关系分析显示,VIb亚型可进一步为VIb1～VIb5 5个进化分支,其中我国分离株都位于VIb1和VIb4进化分支中。氨基酸序列比对及糖基化位点分析显示,P/Anhui/1/09的F蛋白裂解位点氨基酸序列为112K-R-Q-K-R-F117,与NDV强毒株分子特征相符,并发现在七肽重复区旁497位新增一个潜在N-糖基化位点,除2个基因III型日本分离株(Miyadera和MIY/51)外,所有含497位新增糖基化位点的毒株都位于VIb1分支。包含P/Anhui/1/09株在内的大部分鸽源毒株在F蛋白aa132S(融合肽区)、aa259H和HN蛋白aa3H(胞质区)、aa122R、aa347G、aa349E存在一定特征性。     

藏鸡NDV的分离鉴定及F基因的遗传进化分析

【目的】探讨藏鸡NDV的毒力和F基因的遗传进化特征。【方法】从采集的藏鸡病料中分离鉴定NDV,通过测定鸡胚平均致死时间（MDT）和1日龄雏鸡脑内接种致死指数（ICPI）来确定分离株的毒力。采用RTPCR方法克隆藏鸡NDV分离株F基因,测序后进行序列分析,并进行进化分析。【结果】共分离鉴定出F5、FX10、F20、F74、F75、F17、F72、FH2等8株NDV,其中F17、F72、FH2为强毒株,其余5株为弱毒株。8株病毒F基因ORF均为1 662 bp,编码553个氨基酸,强毒株ORF编码产物含有12个半胱氨酸残基,弱毒株有13个半胱氨酸残基,比强毒株在27位(强毒株C²⁷变为R²⁷)多了1个半胱氨酸残基;有6个潜在的糖基化位点。分离的8株NDV与GenBank中发表的20株NDV参考毒株比较结果表明,F蛋白氨基酸序列变异位点较多,主要集中在8-30,97-124,45,385-386,402-403,479-494,509-520位氨基酸处,强毒株AA替代较集中,而弱毒株保守区较多且AA替代较分散。分离NDV株之间F基因编码区核苷酸序列同源性为83.5%～99.9%,其中强毒株之间同源性为95.2%～99.4%,弱毒株之间同源性为99.4%～99.9%。分离NDV株之间F基因编码的氨基酸同源性为87.5%～99.5%,其中强毒株之间同源性为95.3%～98.2%,弱毒株之间同源性为98.6%～99.5%。进化分析显示,3株强毒株均为基因Ⅶ型,5株弱毒株均为基因Ⅱ型。【结论】分离了8株藏鸡NDV,其中3株为强毒株,属于基因Ⅶ型;5株为弱毒株,属于基因Ⅱ型。     

5株H9N2亚型禽流感病毒HA、NA基因的序列分析

为了从分子生物学角度了解H9N2亚型禽流感病毒（AIV）在广西的遗传变异情况,对5株不同年代的广西H9N2亚型AIV的HA和NA基因进行克隆测序及同源性、遗传进化分析。结果表明,5株分离株均为低致病性AIV（LPAIV）,HA、NA基因均属于欧亚谱系中的DK/HK/Y280/97（第I亚群）,与我国代表株CK/BJ/1/94HA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.5%～95.9%,NA基因核苷酸、氨基酸同源性为93.8%～95.8%。分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05HA基因第226位氨基酸由谷氨酰胺（Gln）突变为亮氨酸（Leu）,具备人类流感病毒的受体特征,而在糖基化位点方面,除了CK/GX/6/00HA基因的第218位发生变异以外,5株分离株HA基因上其余各糖基化位点均未发生变异;分离株DK/GX/51/05、CK/GX/55/05、QA/GX/B1/06NA基因均缺失第63、64、65位3个氨基酸,导致1个糖基化位点缺失,而CK/GX/6/00、WB/GX/A1/06NA基因则未发生缺失。     

5株野生鸟类Ⅸ型NDV分离株HN基因的分子特征分析

【目的】探讨新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶基因(HN基因)的分子进化特点,为科学防控新城疫(Newcastle disease,ND)提供依据。【方法】对2008年从陕西省周至县楼观台及其周边地区分离的5个野生鸟类NDV毒株的HN基因进行扩增与测序,与8个国内外不同时期已发表的NDV毒株HN基因进行核苷酸和推导的氨基酸序列的遗传变异分析及分子特性研究。【结果】所有分离株与国内参考强毒株F48E9和国外参考强毒株Herts-33在HN基因C末端终止密码子的位置相同,符合强毒株的特征。从核苷酸和氨基酸同源性来看,分离株与F48E9的核苷酸和氨基酸同源性分别为99.6%~99.8%和99.1%~99.7%,与LaSota、B1和clone-30的同源性分别为90.2%~91.8%和87.9%~88.5%,与ZJ1的同源性为84.8%~85.0%和89.3%~89.7%;从系谱进化分析来看,这5个毒株与F48E9关系较近,同属一支,与LaSota、ZJ1、Herts-33等疫苗株和参考毒株关系较远。【结论】该生态区NDV野生鸟类分离株与目前流行的基因Ⅶ型毒株和传统疫苗毒株的关系较远,且具有强毒株的分子特征,因此必须加强该地区野生鸟类新城疫病毒的监测。     

新城疫病毒HN09-69株P基因的克隆、序列分析及表达

【目的】对新城疫病毒(NDV)HN09-69株P基因进行克隆、序列分析和表达鉴定,为研究P和V蛋白的功能,及NDV新流行毒株的免疫预防提供理论依据。【方法】以HN09-69株NDV为研究对象,根据GenBank上发布的相关P基因参考序列设计引物,进行RT-PCR扩增、克隆和序列测定分析,将P基因的核苷酸序列与相关参考株的P基因序列进行比对分析并构建进化树。将P基因克隆到原核表达载体PET28a(+)中,得到重组质粒rPET28a(+)-P,将重组表达质粒转化到BL21（DE3）中诱导表达,用SDS-PAGE电泳和Western blotting检测表达情况。【结果】扩增出了HN09-69株P基因的ORF,序列长度为1 188 bp。NDV HN09-69株核苷酸与弱毒株La Sota、clone-30同源性分别为82.5%和82.4%,与强毒株F48E8同源性为84.9%,与鸭源,鹅源NDV核苷酸同源性分别为97.9%～98.4%和96.0%～98.0%。SDS-PAGE电泳和Western blotting检测结果表明,重组P蛋白分子质量约为54 ku,符合预期结果,在大肠杆菌中主要以可溶性的形式表达。【结论】NDV HN09-69株与SDWF-02和SD-09鸭源强毒分离株同源性高,亲缘关系近。重组P蛋白在大肠杆菌中得到了高效表达。     

新城疫病毒分离株P基因的分子特性和遗传进化

【目的】探讨新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)磷蛋白基因(P基因)的分子进化特点,为科学防控新城疫(Newcastle disease,ND)提供依据。【方法】对1997~2007年国内分离的13个NDV毒株的P基因进行扩增测序,与15个已发表的国内外不同时期的NDV毒株P基因进行核苷酸和推导的氨基酸遗传变异分析及分子特性研究。【结果】国内NDV分离株P基因核苷酸和P蛋白氨基酸高度同源,同源性分别为93.9%~99.8%和93.4%~99.2%。国内NDV毒株与LaSota、Clone30和F48E9等P基因核苷酸和P蛋白氨基酸同源性分别为82.2%~87.7%,81.3%~83.8%;与国外毒株则分别为82.1%~90.2%,81.1%~90.7%。氨基酸序列分析表明,我国毒株具有独特的氨基酸位点。分子进化分析表明,NDVP基因中核苷酸同义替代率高于非同义替代率。【结论】国内分离NDV毒株P蛋白遗传距离较近,而与LaSota、Clone30、F48E9以及国外毒株遗传距离较远,有一定的地域性。NDVP基因以净化选择的方式进化。     

犬源H9N2亚型流感病毒的遗传进化及其致病性分析

【目的】明确犬源H9N2亚型流感病毒的分子变异特征及致病性,为今后探究流感病毒的禽—犬跨种传播机制提供科学依据。【方法】从流浪犬中分离H9N2亚型流感病毒,利用RT-PCR扩增其8个基因节段进行BLAST同源比对,然后基于国内外的22株参考毒株进行遗传进化分析,并通过小鼠滴鼻感染试验评估分离毒株的致病性。【结果】从采集的393份犬鼻拭子样品中分离获得1株H9N2亚型流感病毒,命名为A/canine/Guangxi/LZ11/2018(简写为LZ11)。分离毒株LZ11为三重组毒株,其中,HA、NA和NS基因属于BJ/94类谱系,PB2和M基因属于G1类谱系,PB1、PA和NP基因属于F/98类谱系;病毒基因组成属于近年我国广泛流行的S基因型。分离毒株LZ11的HA蛋白在第324~331位存在1个裂解位点(PSRSSR↓GL),符合低致病性流感病毒的特征;HA蛋白还出现226Q→L突变,具有优先结合人类α-2,6唾液酸受体的能力;NA蛋白在119E、151D、276E、292R和294N未发生突变,但M2蛋白出现31S→N突变,说明分离毒株LZ11仍对神经氨酸酶抑制剂敏感,但已对金刚烷胺类药物产生耐药性;聚合酶蛋白出现多个哺乳动物适应性相关的氨基酸位点突变,包括PB2蛋白的292I→V、PB1蛋白的368I→V及PA蛋白的409S→N和356K→R。分离毒株LZ11虽然未引起小鼠出现典型的临床症状,但可在肺脏和上鼻窦有效复制,病毒滴度分别为3.82和5.98 lg PFU/mL。【结论】分离获得的犬源H9N2亚型流感病毒属于近年流行的S基因型,其8个基因节段分属于3种谱系(BJ/94类谱系、G1类谱系和F/98类谱系),且存在多个哺乳动物适应性相关氨基酸位点突变,具备感染哺乳动物的分子特征,可在小鼠脏器内有效复制。鉴于人类与宠物犬的密切关系,今后应加强对犬源H9N2亚型流感病毒的监测与防控。     

鸡大肠杆菌TEM和CTX-M型超广谱β-内酰胺酶基因分型研究

 【目的】检测鸡大肠杆菌超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)的基因型和基因亚型,了解河南省产酶鸡大肠杆菌ESBLs基因型分布。【方法】 对河南省7个地区不同鸡场临床分离28株产ESBLs鸡大肠杆菌分别用TEM、SHV和CTX-M等3种通用引物进行PCR扩增及测序分析,确定其基因型和基因亚型。【结果】 21株鸡大肠杆菌检出TEM型基因,2株检出CTX-M型基因,5株检出TEM型和CTX-M型两种基因,未检出SHV型。TEM基因亚型以TEM-1变异型为主,与AY293072(TEM-1)相比同源性为98%—99%,核苷酸序列除发生18T→C沉默突变外,尚有3株分别有另一处碱基发生变化：783G→A(C3菌,序列号为FJ405207)、21T→A(X2菌,序列号为FJ405208)和269G→A(F4菌,序列号为FJ405211),其中前两处为沉默突变,F4菌的碱基突变引起92甘氨酸变为天冬氨酸,为TEM-57型。CTX-M基因亚型包括两种：CTX-M-65亚型4株(C2、C3、C4和K1,序列号分别为FJ405191,FJ405192,FJ405212和FJ405214)和CTX-M-14亚型3株(F2、X3和B5,其中F2菌的相关序列已上传至GenBank,获序列号为FJ405213)。【结论】 目前河南省产ESBL鸡大肠杆菌基因亚型以TEM-1变异型为主,CTX-M-65和CTX-M-14型次之。     

柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

 【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白（CP）基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒（CTLV）分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714 nt, 推导的CP含237个氨基酸。CP核苷酸序列及推导的氨基酸序列最大相似性分别为88.5％～99.9％和91.1％～99.6％。与核苷酸序列G289→A或C、A409→C和G414→T的单碱基突变相对应,CTLV外壳蛋白第97、137、138位氨基酸在强、弱毒分离物之间存在差异,多数弱毒分离物为Q97或K97、Q137、H138,而多数强毒分离物为E97、R137或K137、Q138。在根据CP氨基酸序列构建的系统进化树上,本研究获得的18个CTLV分离物至少可以划分为2个组群,其中,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在第Ⅰ组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物划分在第Ⅱ组群。【结论】CTLV外壳蛋白基因相对保守,其第289、409、414位碱基在强、弱毒分离物之间存在差异,可能与病毒致病性相关。     

养殖场分离的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌基因突变研究

【目的】探讨从养殖场动物、环境和饲养员分离的大肠杆菌的gyrA 和parC 基因突变特征。【方法】用琼脂稀释法测定环丙沙星和恩诺沙星对菌株的最小抑菌浓度。PCR扩增gyrA 和parC 基因的喹诺酮耐药决定区，扩增的片段长度分别为525 bp和487 bp，PCR产物直接测序。【结果】在63株突变株中，在GyrA 亚基发生的氨基酸替代有Ser83→Leu（62株）和Asp87→Asn（52株）、Asp87→Tyr（2株）、Asp87→His（2株）；ParC 亚基的氨基酸替代有Ser80→Ile（47株）、Ser80→Arg（2株）和Glu84→Val（3株）、Glu84→Lys（4株）、Glu84→Gly（5株）、Glu84→Ala（1株）。环丙沙星对菌株的MIC小于0.125μg·ml-1时，GyrA和ParC亚基均没有任何变异；环丙沙星的MIC为0.125～0.25 μg·ml-1时，GyrA亚基出现单一氨基酸替代；环丙沙星的MIC为0.5～32μg·ml-1时，出现GyrA 83位和87位双替代或者GyrA83和ParC80位双替代；环丙沙星的MIC为4～128μg·ml-1，发生GyrA 双替代和ParC单替代；环丙沙星的MIC在16～128μg·ml-1，发生GyrA双替代和ParC 双替代。【结论】不同来源的耐氟喹诺酮类药物的大肠杆菌GyrA和ParC具有多种氨基酸替代类型，而且GyrA和ParC突变位点的数量与菌株对氟喹诺酮类耐药水平呈正相关。     

新城疫病毒河北分离株F基因的克隆与序列分析

通过RT-PCR技术扩增和克隆2003—2007年由河北省分离到的、具有一定代表性的鸡新城疫病毒分离株F基因,与GeneBank中已发表的NDV不同基因型代表株F基因相应核苷酸片段及其氨基酸序列进行比较,构建系统发育进化树并确定分离株的毒力强弱及所属基因型。结果显示,分离株在该区段没有碱基缺失和插入,但有多处点突变分散存在。分离株F基因核苷酸序列与国内外已发表毒株相应序列核苷酸同源性为80.5%~98.5%,推导的氨基酸序列同源性为77.5%~97.7%。表明目前河北新城疫的流行以基因Ⅶ型为主,同时兼有传统的基因Ⅵ型和基因Ⅱ型。     

SYBR GreenI模式荧光RT-PCR鉴别新城疫病毒毒力

 【方法】根据NDV的F蛋白裂解位点附近的序列，设计分别对应于NDV强毒和弱毒的两对引物，然后用SYBR Green I模式的荧光RT-PCR方法比较两对引物对同一NDV的RNA扩增效率以及扩增产物的Tm值，来区分NDV的毒力。【结果】对8株NDV进行检测并测定其鸡胚平均致死时间（MDT），荧光RT-PCR方法的检测结果和MDT测定的结果完全一致，说明此荧光RT-PCR法可用于NDV毒力检测。     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。