小反刍兽疫病毒RT-LAMP检测方法的建立

利用逆转录环介导等温核酸扩增技术(RT-LAMP)建立了小反刍兽疫病毒快速检测方法,同时评价了该方法的灵敏性和特异性。结果表明,根据小反刍兽疫病毒N基因保守区域设计的LAMP引物能够在63℃恒温下,1小时内实现目的核酸的大量扩增,由于在检测前加入荧光指示试剂,检测结果可以直接用肉眼判断,避免了由于开盖检验带来的扩增产物污染导致的假阳性。该检测体系具有较高的特异性,只能特异性地检测目的病毒,与其他同属的病毒或类似病毒等无交叉反应;具有较高的检测灵敏度,比普通RT-PCR灵敏性高10倍,与荧光RT-PCR的灵敏度相当。     

水疱性口炎病毒RT-LAMP快速检测方法的研究

根据逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)原理,针对水疱性口炎病毒(VSV)糖蛋白G基因序列中的6个区域设计内外各1对特异引物,建立扩增VSV糖蛋白(G)基因的RT-LAMP方法。扩增产物电泳呈特异的阶梯状条带分布,扩增产物加SYBR GREEN I染色呈特征性的黄绿色,肉眼可直接观察判定。同时,还建立了可以进行定量检测的实时RT-LAMP方法。特异性试验显示,本方法可快速检验鉴别VSV与口蹄疫病毒(FMDV)和猪水泡病病毒(SVDV)。敏感性试验显示,建立的实时RT-LAMP方法检测VSVRNA的最低检测量为0.01 PFU,比实时荧光RT-PCR显著提高。建立的LAMP方法可检测p-VSVNJ质粒DNA的最低量为6.36×10-3pg/μL(1.4×103copies/μL),比PCR也显著提高。综合表明,本研究建立RT-LAMP检测VSV的方法具有特异、敏感、快速、简便的特点,具有开发应用前景。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒RT-LAMP可视化检测方法的建立

为建立一种快速检测鸭Ⅰ型肝炎病毒(DHV I)的方法,本研究根据基因库中DHV Ⅰ基因的保守序列,设计特异性环介导等温扩增(LAMP)引物,建立了DHV I的RT-LAMP可视化检测方法。该方法的敏感性可达10fg,高于常规PCR方法 100倍;全部反应可在1 h内完成;可以通过肉眼观察颜色直接判定结果;对其它鸭常见病原体的检测结果均为阴性。实验结果表明建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,可用于DHV Ⅰ感染的快速检测。     

牛副流感病毒3型RT-LAMP检测方法的建立及应用

本试验根据GenBank中登录的牛副流感病毒3型(BPIV-3)基因序列,利用在线软件Primer Explorer V4 Software和Primer Premier 5.0,针对BPIV-3 NP基因序列的保守区设计并筛选了一套环介导逆转录等温核酸扩增(RT-LAMP) 引物,建立BPIV-3特异性检测的RT-LAMP方法。在Bst DNA聚合酶作用下,63 ℃恒温反应1 h即可完成扩增过程,扩增产物通过浑浊度比较、凝胶电泳和肉眼可视化进行判定。结果表明,该方法比RT-PCR敏感度更高,最低检出量可达0.069 fg/μL。该方法可用于牛副流感病毒3型的实验室检测和临床初步诊断。     

猪脑心肌炎病毒RT—LAMP检测方法的建立

针对猪脑心炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）3D基因保守序列的6个特异性部位设计了2对引物,利用BstDNA聚合酶,63℃恒温保持50min即可完成反转录与扩增反应,产物中加入SYBR GreenI染料,在紫外光下可直接观察判定扩增结果,试验成功建立了猪EMCV的RT-LAMP检测方法。结果表明：该方法灵敏度比RT-PCR高100倍,具有良好的重复性和稳定性,而且对其他病毒均无扩增结果,可作为猪EMCV的快速诊断方法。     

猪日本脑炎病毒NS3基因实时RT-LAMP快速检测方法的建立

建立日本脑炎病毒一步法实时环介导逆转录等温快速扩增方法.根据日本脑炎病毒序列保守的非结构区基因NS3设计4条特异引物,用于扩增SA14-14-2株、SA103株和GD06株日本脑炎病毒获得成功,在病毒感染的单层细胞和猪体内都可以检出病毒.与常规SYBR GreenI适时荧光RT-PCR方法比较和Ct值分析,用不同稀释度病毒RNA,两者敏感性相似,适时RT-PCR在模板浓度低时结果更稳定.FIP和BIP纯度会影响反应效果,反应时间和模板浓度会影响电泳条带.一般63 ℃~65 ℃ 30 min可出现结果,模板浓度低时要适当延长反应时间.以SYBR GreenI为指示剂,RT-LAMP在63 ℃~65 ℃循环扩增检测日本脑炎病毒,1.5 min/循环,30个循环,Ct值为21.5.提示RT-LAMP方法用于日本脑炎诊断、鉴别,是敏感、可靠、成本低廉的方法,有助于人畜日本脑炎的防控工作.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏、简便的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）早期检测方法,本研究利用逆转录环介导恒温扩增技术（RT-LAMP）,针对PRRSV的ORF5基因片段设计了4条引物,利用Bst DNA聚合酶在65 ℃恒温条件下进行逆转录扩增,通过1.0%琼脂糖凝胶电泳和加入SYBR Green Ⅰ染料肉眼判断结果,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。结果表明,该检测方法具有良好的特异性,与其他常见病毒如猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒等无交叉反应,较普通RT-PCR灵敏性高100倍。采用RT-LAMP和RT-PCR分别对10份临床样本同时进行检测,符合率为100%。因此,本研究建立的RT-LAMP是一种可适用于临床PRRSV检测的快速、简单、灵敏、特异的检测方法。     

禽新型黄病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据环介导等温扩增技术(LAMP),建立了一种适用于禽新型黄病毒的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法。根据禽新型黄病毒E蛋白基因序列,在保守区设计了一套针对禽新型黄病毒基因8个区域的6条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果表明该方法对NDRV、GPV、MDRV、NDV、ILTV、FPV均无扩增反应,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化观察;扩增反应只需要在常规水浴锅中进行,45min内可完成反应;该方法对禽新型黄病毒RNA的最小检测限为1pg,灵敏度是一步法RT-PCR方法的100倍。本研究建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行禽新型黄病毒的快速检测。     

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察.整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应.本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术.     

犬瘟热病毒野毒株与疫苗株鉴别检测RT-LAMP方法的建立

为建立一种鉴别犬瘟热病毒(CDV)野毒株与疫苗株的反转录-环介导等温扩增方法(RT-LAMP),本研究通过比对野毒株与疫苗株H基因设计特异性引物,对反应体系中的Mg2+、Betaine、Bst DNA Polymerase、dNTP和反应温度等条件分别进行优化,建立用于鉴别检测CDV野毒株与疫苗株的RT-LAMP。建立的RT-LAMP方法检测CDV野毒株时,在65℃水浴锅中反应40 min即可完成。该方法具有高度特异性,对犬细小病毒、犬腺病毒、狂犬病毒、犬冠状病毒无交叉反应,敏感度可达40 copies/μL,是常规RT-PCR方法的100倍。     

猪瘟病毒野毒株RT-LAMP可视化检测方法的建立

本研究旨在建立一种可视化检测猪瘟病毒(CSFV)野毒株的反转录.环介导等温扩增方法(RT-LAMP).根据CSFV的NS5B基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,利用Bsf DNA聚合酶,在62℃恒温条件下进行扩增,扩增产物中加入sYBR Green I染料直接或在紫外光下观察判定扩增结果.该方法可检测出不同基因型的CSFV厂野毒株,其检出极限为2.5 TCID_(50)的CSFV,与实时荧光定量RT.PCR方法的敏感性相当;特异性试验表明,该方法对猪瘟免化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒均无扩增反应;通过对126份不同样品进行检测比较,该方法与实时荧光定量RT-LAMP检测方法的符合率达100%.与引物.探针能量转移PCR方法的符合率为98.4%.该方法无需特殊仪器,是一种适用于基层的快速、简便的CSFV野毒鉴别检测方法.     

猪瘟病毒RT—LAMP实验诊断初报

为了探索猪瘟病毒诊断的新方法,本研究采用环介导等温扩增法（RT-LAMP）与RT—PCR方法分别对随即采样的80份猪瘟疑似病料进行猪瘟病毒实验室诊断及对比研究。结果表明RT-LAMP与RT—PCR检测得出的阳性率分别为38．75％和36．25％。RT—LAMP检测方法更加灵敏、特异、快速,可用来检测猪瘟病毒,在等温条件下进行,不需要复杂的仪器,操作简单,整个扩增反应可在1h内完成,为临床检测猪瘟病毒提供了一个快速简便的分子生物学方法。