猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

为建立一种快速、灵敏、简便的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）早期检测方法,本研究利用逆转录环介导恒温扩增技术（RT-LAMP）,针对PRRSV的ORF5基因片段设计了4条引物,利用Bst DNA聚合酶在65 ℃恒温条件下进行逆转录扩增,通过1.0%琼脂糖凝胶电泳和加入SYBR Green Ⅰ染料肉眼判断结果,建立了PRRSV RT-LAMP检测方法。结果表明,该检测方法具有良好的特异性,与其他常见病毒如猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒等无交叉反应,较普通RT-PCR灵敏性高100倍。采用RT-LAMP和RT-PCR分别对10份临床样本同时进行检测,符合率为100%。因此,本研究建立的RT-LAMP是一种可适用于临床PRRSV检测的快速、简单、灵敏、特异的检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒M基因RT-LAMP检测方法的建立

本研究根据GenBank中登录的猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)M基因保守序列6个特异性部位设计了 2对引物,建立了PRRSV的环介导逆转录等温检测方法。结果表明,该方法灵敏度比RT-PCR高100倍;全部反应可在1 h内完成并可得到其特有的阶梯状条带,而且猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒的扩增结果均为阴性;在反应体系中添加SYBR GREENⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光而直接判定结果。该方法灵敏度高、特异性好,可作为猪繁殖与呼吸综合征病毒的快速诊断方法。     

鸭坦布苏病毒可视化RT-LAMP快速检测方法的建立与初步应用

为实现鸭坦布苏病毒（duck tembusu virus,DTMUV）的快速检测,本研究根据GenBank中公布的DTMUV E蛋白基因的高度保守序列设计了1套引物,通过优化反应体系各组分的浓度、反应时间和温度,建立了一种灵敏、便捷的RT-LAMP扩增方法。结果显示,在最佳条件下甜菜碱对反应体系影响不明显;该方法灵敏度是常规RT-PCR的100倍;只能特异性扩增坦布苏病毒,对于其他常见的禽源病毒无特异性扩增;检测结果可直接通过肉眼观察来判断;对临床74份疑似病料,可检出65份。本试验建立的方法灵敏性高、特异性强,可用于鸭坦布苏病毒病的临床诊断和流行病学调查。     

Establishment and Application of Visual RT-LAMP for Rapid Detection of Duck Tembusu Virus

To realize the rapid detection of duck tembusu virus (DTMUV), a set of specific primers was designed according to the highly conserved sequence of DTMUV E protein gene published in GenBank. A sensitive and convenient RT-LAMP amplification method was established by optimizing the concentrations of each component, reaction time and temperature in the reaction system. The results showed that the influence of betaine on the reaction system was not obvious under the optimal conditions. This method was 100 times more sensitive than the conventional RT-PCR. The RT-LAMP method specifically amplified tembusu virus but not other common avian viruses. The results could be differentiated by naked eyes. 74 clinic suspicious samples were tested and 65 of them were positive. These results suggested that the RT-LAMP assay could be used as a method for the diagnosis and detection of clinical cases, and molecular epidemiological investigation of duck tembusu virus disease.     

猪瘟病毒和不同型猪繁殖与呼吸综合征病毒的多重RT-PCR检测方法的建立

为建立能同时检测猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的方法,针对CSFV和PRRSV的基因序列设计3对特异性引物,第1对引物扩增CSFV毒株NS2基因508bp片段,第2对引物扩增PRRSV美洲型经典毒株和变异毒株Nsp2基因338bp/248bp片段,第3对引物扩增PRRSV欧洲型毒株ORF5基因614bp片段。经过反应条件的优化,建立了能同时检测并区分CSFV毒株和PRRSV美洲型经典毒株、变异毒株及欧洲型毒株的多重RT-PCR方法。该方法可以特异扩增CSFV和PRRSV,而与猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)均无交叉反应;对CSFV和PRRSV 4种重组质粒标准品的检出下限均为1.67×103拷贝/μL。对采集的106份临床疑似病料进行检测,结果CSFV和PRRSV变异株混合阳性4份,占3.77%(4/106);CSFV阳性7份,占6.60%(7/106);PRRSV变异株阳性17份,占16.04%(17/106)。结果表明,建立的多重RT-PCR检测方法可以用于CSFV和PRRSV的临床快速鉴别诊断和流行病学调查。     

禽新型黄病毒RT-LAMP检测方法的建立

根据环介导等温扩增技术(LAMP),建立了一种适用于禽新型黄病毒的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)快速检测方法。根据禽新型黄病毒E蛋白基因序列,在保守区设计了一套针对禽新型黄病毒基因8个区域的6条特异性引物,并对反应条件进行优化。结果表明该方法对NDRV、GPV、MDRV、NDV、ILTV、FPV均无扩增反应,并可通过反应液是否有沉淀或向反应液中加入荧光染料来对结果进行可视化观察;扩增反应只需要在常规水浴锅中进行,45min内可完成反应;该方法对禽新型黄病毒RNA的最小检测限为1pg,灵敏度是一步法RT-PCR方法的100倍。本研究建立的RT-LAMP方法简便、快速、灵敏、特异,适合在基层进行禽新型黄病毒的快速检测。     

猪瘟病毒RT—LAMP实验诊断初报

为了探索猪瘟病毒诊断的新方法,本研究采用环介导等温扩增法（RT-LAMP）与RT—PCR方法分别对随即采样的80份猪瘟疑似病料进行猪瘟病毒实验室诊断及对比研究。结果表明RT-LAMP与RT—PCR检测得出的阳性率分别为38．75％和36．25％。RT—LAMP检测方法更加灵敏、特异、快速,可用来检测猪瘟病毒,在等温条件下进行,不需要复杂的仪器,操作简单,整个扩增反应可在1h内完成,为临床检测猪瘟病毒提供了一个快速简便的分子生物学方法。     

PRRSVNsp9蛋白基因的RT—LAMP检测方法的建立

根据GenBank中登录的PRRSVNsp9基因序列,应用PrimerExplorerV4软件,在该基因序列中选取保守区设计了4条RT—LAMP引物,旨在建立1种针对Nsp9蛋白基因的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）的快速检测方法。采用引物分组扩增的方法对引物进行了检测,以确保引物的可靠性。对反应体系、温度以及时间进行了优化,检测了该方法的特异性和灵敏度。结果表明,该方法在等温条件下只需50min就能检测出结果。与RT-PCR方法相比,在判定检测结果时不需要借助昂贵仪器设备,具有高特异性、高灵敏度、操作简便快速等特点,适合于临床检测的应用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光定量RT-PCR和RT-LAMP快速检测方法的建立

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）是世界各地重要猪病毒性病原之一,每年给养猪业造成重大损失。本试验建立了应用TaqMan-LNA的荧光定量RT-PCR和逆转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)2种PRRSV检测方法。结果表明荧光定量RT-PCR和RT-LAMP检测下限分别为10²和10¹ 拷贝数/μL,都具有良好的特异性。临床样本检测结果同样表明2种方法都具有良好的特异性和灵敏度。本试验所建立的TaqMan-LNA荧光定量RT-PCR和RT-LAMP可有效的应用于PRRSV的检测。     

猪流行性腹泻病毒环介导等温扩增检测方法的建立及应用

试验旨在建立一种快速检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）的环介导等温扩增方法（LAMP）,为诊断PEDV提供简便、敏感、准确可靠的工具。参考GenBank中PEDV基因序列（登录号：KT799997）,针对PEDVN基因设计了6条引物,对所建立的LAMP反应体系、反应温度进行优化,建立可特异性扩增PEDV的LAMP方法。结果显示,本试验成功建立了PEDV LAMP检测方法,在60℃恒温下反应60 min,能特异性地检测PEDV,检测限量为91拷贝/μL,比常规PCR方法的敏感性高100倍。对比75份临床样本的LAMP和常规RT-PCR法检测结果,显示两种方法符合率为97.3%。综上所述,本试验建立的LAMP方法具有特异性强、敏感性高,操作简单,设备要求低的特点,适用于PEDV临床样本的快速检测。     

Establishment and Application of Loop-mediated Isothermal Amplification for Rapid Detection of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

This study was aimed to establish a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for detection of porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), and provide a simple, sensitive, accurate and reliable tool for diagnosis of PEDV.The conservative PEDV N gene (GenBank accession number: KT799997) of PEDV was selected as a target to design six specific primers.The reaction system and temperature of LAMP were optimized, and the LAMP method for specific amplification of PEDV was established. Results showed that the PEDV LAMP detection method was established successfully, and it could detect PEDV specifically at 60℃ for 60 min,and the detection limit was 91 copies/μL, which was one hundred-fold higher than conventional RT-PCR method.75 clinical samples were detected by LAMP and PCR, respectively, the coincidence of LAMP and PCR was about 97.3%. All the data suggested that the LAMP assay had strong specificity, high sensitivity, simple operation, low equipment requirement, and was suitable for rapid detection of PEDV clinical samples.     

猪瘟病毒野毒株RT-LAMP可视化检测方法的建立

本研究旨在建立一种可视化检测猪瘟病毒(CSFV)野毒株的反转录.环介导等温扩增方法(RT-LAMP).根据CSFV的NS5B基因序列设计一套RT-LAMP引物,以样品的cDNA为模板,利用Bsf DNA聚合酶,在62℃恒温条件下进行扩增,扩增产物中加入sYBR Green I染料直接或在紫外光下观察判定扩增结果.该方法可检测出不同基因型的CSFV厂野毒株,其检出极限为2.5 TCID_(50)的CSFV,与实时荧光定量RT.PCR方法的敏感性相当;特异性试验表明,该方法对猪瘟免化弱毒疫苗株(HCLV)、牛病毒性腹泻病毒以及其它常见猪源病毒均无扩增反应;通过对126份不同样品进行检测比较,该方法与实时荧光定量RT-LAMP检测方法的符合率达100%.与引物.探针能量转移PCR方法的符合率为98.4%.该方法无需特殊仪器,是一种适用于基层的快速、简便的CSFV野毒鉴别检测方法.     

用免疫金技术检测猪繁殖与呼吸综合征病毒

用胶体金标记提纯后的兔抗猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV)IgG ,建立了一种以微孔滤膜为固相载体 ,以红色胶体金为标记物的检测PRRSV的斑点免疫金渗滤法 (DIGFA)。特异性阻断试验与交叉试验证明DIGFA检测PRRSV有较高的特异性。检测 1 5份临床样本 ,其中 3份DIG FA及细胞培养均为阳性 ,电镜观察亦可见符合PRRSV特征的病毒粒子     

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察.整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应.本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术.     

Development of Loop-mediated Isothermal Amplification Assay for Detection of Torque teno sus Virus Type 2

In order to develop a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assay for rapid and specific detection of Torque teno sus virus type 2 (TTSuV2), two pairs of primers were designed according to the untranslated regions and the part of open reading frame 1 of TTSuV2.The LAMP system was optimized by adjusting the concentrations of some components and reaction conditions.The optimized amplification conditions of LAMP assay was at 64 ℃ for 90 min.The results showed the LAMP assay was specific for TTSuV2 detection, which could achieve a detection limit of 100 copies/μL viral nucleic acid, and no cross-reaction with TTSuV1, PCV2, CSFV, PRRSV and PBoV.In conclusion, this assay was a rapid, specific and sensitive detection technique which could provide a assistance for the rapid detection of TTSuV2.     

猪细环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立

为了能快速、特异的检测猪细环病毒2型(TTSuV2),本研究针对TTSuV2全基因序列的非编码区域和第1个开放性阅读框前端设计了2对引物,建立了TTSuV2的环介导等温扩增(LAMP)检测方法并对反应成分和条件进行了梯度摸索。试验结果显示,该LAMP检测方法最佳反应条件为64 ℃恒温90 min,可特异性检测TTSuV2,与猪细环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪博卡病毒无交叉反应,病毒最低检出限为100拷贝/μL。结果表明,建立的LAMP方法具有快速、特异且灵敏的特点,可在TTSuV2快速检测方面提供一定的技术支持。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TaqMan-MGB实时荧光定量RT-PCR方法的建立及应用

为了快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRSV),本研究根据PRRSV基因序列设计特异性引物和探针,建立了一种可同时检测PRRSV经典毒株、高致病性变异毒株以及近几年中国新出现的NADC30-like毒株的TaqMan-MGB实时荧光定量方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行验证,同时用建立的实时荧光定量方法与常规PCR方法对临床收集的120份疑似PRRSV样品进行检测。结果表明,该方法特异性良好,对PRRSV的经典毒株、高致病性变异毒株及NADC30-like毒株均有良好的扩增,但对猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性,无交叉反应;模板浓度在101～108拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,标准曲线结果显示其扩增的相关系数为0.9999,扩增效率为93%;敏感性高,约是常规PCR方法的100倍,最低可以检测到101拷贝/μL的模板;重复性好,批内和批间重复性试验变异系数分别为0.17%～0.90%和0.65%～2.34%;用本研究所建立的实时荧光定量检测方法对120份临床样品进行检测,PRRSV阳性检出率为59.2%(71/120),而常规PCR方法的PRRSV阳性检出率为44.2%(53/120)。该方法的建立为PRRSV的实验室诊断、流行病学调查,以及预防和控制中国PRRSV的流行提供了快速、准确的检测手段。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒的RT-PCR快速诊断技术研究

根据猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)的N基因序列设计了一对引物,建立诊断PRRSV的RT-PCR技术。使用该方法对山东某些地区疑似为PRRS的28份送检样品进行检测,结果4份为阳性,证实山东存在PRRSV的流行。RT-PCR方法的建立为PRRS的快速、准确诊断以及进行分子流行病学的调查提供了新的技术手段。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞受体Sn和CD163TaqMan荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)允许细胞表面的Sn和CD163受体的方法,本研究设计针对Sn和CD163基因的特异性引物和荧光探针,建立了检测PRRSV Sn和CD163受体的荧光定量RT-PCR方法.结果显示,该方法在检测101 copies/μL～108 copies/μL模板范围内具有良好的线性关系.标准曲线的相关系数r值均大于0.996,扩增效率分别为100％和107％;该检测方法对Sn和CD163的检测下限均为10拷贝,敏感性高;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均小于5％,具有良好的重复性.利用该方法对PRRSV感染肺泡巨噬细胞(PAM) 72 h后Sn和CD163受体mRNA的转录水平进行了检测,结果表明Sn和CD163受体的转录 水平显著上调.本研究为PRRSV病毒感染后两种主要受体变化趋势的研究提供了有效的检测方法.