纳豆激酶溶血栓作用的研究

本研究通过纳豆激酶纤维蛋白溶解活性实验、纳豆激酶体内血栓溶解实验对纳豆激酶的溶栓作用做了较全面的研究。对纤维蛋白溶解活性研究结果显示：高、中、低剂量的纳豆激酶均能显著地降低血浆优球蛋白的溶解时间、显著地降低血浆纤维蛋白原的含量、显著地增加纤维蛋白裂解产物的含量,表明纳豆激酶具有较强的纤维蛋白溶解性,且同等剂量的纳豆激酶和尿激酶相比,前者的纤溶性大于后者;体内血栓溶解的实验结果显示：纳豆激酶可明显地延长血栓形成时间、显著减少股动脉的长度及湿重并明显提高血栓的再通率、显著减少肺内血栓的形成,表明纳豆激酶具有较强的体内溶栓作用,且同等剂量的纳豆激酶和尿激酶相比,前者的溶栓作用高于后者。显示了纳豆激酶具有强大的溶栓作用,且起效快、药效长,有望成为一代溶栓药物。     

纳豆激酶研究进展

对纳豆激酶的理化性质、基因与蛋白结构、纳豆激酶基因的克隆与表达及体外溶栓活性测定方面的研究进展进行了综述,并对纳豆激酶的发展前景进行了展望。     

纳豆激酶纤溶活性研究

通过制备纳豆提取激酶、纳豆激酶粗酶,对纳豆激酶纤溶性质进行研究,结果表明:纳豆激酶纤溶活性最适pH为8.0,pH6～10溶液中40℃以下基本稳定,pH<5失去纤溶活性;模拟胃环境的酸性条件下,粗酶失去纤溶活性,而纳豆浸提液纤溶活性保持25%;SDS-PAGE电泳显示,胰蛋白酶对纳豆激酶成分没有降解作用;体外溶栓作用表明,纳豆激酶溶解纤维蛋白的方式是直接溶解,而不是通过激活纤溶酶原。     

一种新型的溶栓药物--纳豆激酶

纳豆激酶具有较高的纤溶活性、无毒无副作用、体内作用时间长、来源广泛价格低廉有望成为新一代溶栓药。     

纳豆激酶生产菌的定向筛选

本实验利用目标纳豆枯草芽孢杆菌所应具有的耐热性，耐盐性及显著的蛋白酶活性等生物学特性设计定向选育方案，从日本纳豆和纳豆发酵剂样品中筛选蛋白酶活力高，并溶血纤维蛋白特异性显著的枯草芽孢杆菌，最终从1种干纳豆中分离筛选出1株芽孢杆菌，代号为：HL986，其培养物中1种蛋白酶的溶栓性和分子量都十分接近已有报道的纳豆激酶（NK）。     

纳豆激酶植物高效表达载体的构建

纳豆激酶来源于日本的传统食品—纳豆,是一种具有强烈溶栓作用的蛋白激酶,将编码纳豆激酶的基因克隆到含C aM V 35S控制下的双元表达载体pCAM B IA 1300中,PCR结果表明,纳豆激酶基因正向插入到载体中,再通过冻融法将其导入根癌农杆菌LBA 4404中,从而成功地构建了能在植物中高效表达的植物载体,为用植物作为生物反应器来获取纳豆激酶蛋白提供了一条新途径。     

纳豆激酶分离提纯方法中试研究

本文在中试规模上对纳豆激酶(Nattokinase，NK；1种溶栓酶)发酵工程的下游主要工艺进行了研究。对纳豆枯草杆菌(HL986)发酵液中初步提取纳豆激酶(NK)进行了探讨。通过加入CaCl1和NaOO3对发酵液的前处理、离心过滤、超滤浓缩、离子交换层析等操作之后．得到了较纯的酶蛋白。整个过程．蛋白收率为17％，酶活性收率为61．74％。若再进行适当完善．本工艺则可以应用于大规模的针剂型纳豆溶栓酶的工业化生产。     

9株纳豆菌产酶活力的比较研究

对9株纳豆菌产纳豆激酶和超氧化物歧化酶活性进行了研究,从中选出1株产纳豆激酶(NK)和超氧化物岐化酶(SOD)能力较高的菌株(NS-W-6)。该菌株在普通大豆培养基上能产生大量纳豆激酶和SOD酶,产纳豆激酶活力为1 766.25 U/mL,超氧化物歧化酶活力为214.85 U/mL。     

纳豆激酶分离纯化及性质研究

在实验室条件下,通过生理盐水浸提、硫酸铵分级沉淀、亲和层析、阴离子交换层析以及凝胶过滤层析,从纳豆中提取纳豆激酶。纯化后的纳豆激酶样品在SDS-PAGE银染中呈单一条带,纯度经密度扫描证实在95%以上,纤溶活性总收率达到52.9%。纳豆激酶性质研究结果发现,其最适pH值为7.5,对温度变化敏感,纤溶活性可被Ca2+,Ba2+,Na+等金属离子激活。纳豆激酶在水溶液中受EDTA强烈抑制及低离子强度条件下产生自我降解现象。     

番茄纳豆激酶基因转化的初步研究

纳豆激酶是一种具有强烈溶栓作用的蛋白激酶.本研究采用农杆菌介导法将质粒pCAMBIA-nk导入番茄外植体,通过潮霉素筛选获得大量抗性愈伤组织,并通过进一步分化、生根培养获得7株转基因植株.PCR检测表明外源纳豆激酶基因已在番茄转基因植株中表达.     

纳豆冻干粉的安全性研究

用菌种BacillusNatto培养纳豆 ,测定了纳豆激酶的活性 ,并将纳豆加工成冻干粉 ,进行安全性试验 ,结果证明纳豆冻干粉对小鼠实际无毒 (LD5 0 >10g/kg) ,骨髓微核试验和精子畸形试验结果呈阴性     

产纤溶酶菌株的分离筛选

以脱脂奶粉作为初筛底物,纤维蛋白作为复筛底物,透明圈作为筛选标记,从肉联厂,污水沟等地筛选出产纤溶酶的菌株40株,从中筛选出产酶活力最高的2号菌株,将其编号为ZLW-2,并采用改进的紫外分光光度法测酶活,提高了酶活测定的精确性,对提高纤溶酶产生菌的筛选效率有重要意义。菌株ZLW-2的发酵过程研究表明,纤溶酶是在菌体大量生长以后酶活力才开始增加。     

纳豆激酶的克隆及在大肠杆菌中的表达

该文采用PCR方法扩增获得了纳豆激酶基因(pro-NK),通过酶切与酶连反应使其与原核表达载体Pet32a相连,构建重组质粒Pet32a-pro-NK,先转入到大肠杆菌DH5α中进行筛选与验证,再将阳性克隆子转化到宿主菌BL21(DE3)中,在IPTG诱导下进行纳豆激酶蛋白的表达研究。SDS-PAGE电泳分析结果表明,纳豆激酶蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达。     

纳豆激酶基因的克隆及表达研究

经PCR扩增获得了纳豆激酶基因(NK).将此基因插入原核表达载体pTWIN1中,使之与几丁质结合域(CBD)一内含肽(intein)融合,获得原核表达质粒pTWIN1/NK.转化宿主菌E.coli BL21(DE3),在IPTG诱导下进行纳豆激酶的表达研究.SDS-PAGE电泳分析结果表明,重组蛋白在BL21(DE3)中获得高效表达,在低温诱导时主要以可溶性蛋白的形式存在.     

豆豉纤溶酶的研究进展

综述了含豆豉纤溶酶基因的枯草杆菌的筛选,酶的分离提取、酶学性质、活性测定,豆豉纤溶酶基因的克隆、表达以及动物溶栓药效试验的研究进展。     

豆豉纤溶酶产酶菌的筛选及菌种保藏

[目的]从豆豉产品中筛选分离活性较高的豆豉纤溶酶产酶菌,并对菌种进行保藏。[方法]用自制的猪血粉为底物配制筛选培养基进行豆豉纤溶酶产酶菌的筛选,然后根据水解圈的大小筛选活性高的产酶菌株,最后将其保藏于LB培养基中。[结果]成功从湖南、广东、江西等地产的豆豉中筛选到一株溶栓活性相对较高的产酶菌。[结论]该研究为新型溶栓药物的开发奠定了基础。     

芽孢杆菌纤溶酶的纯化及其生物活性研究

芽孢杆菌2^#（Bs-2）的发酵液经过硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-75凝胶过滤层析、Q-Sepharose阴离子交换层析、电泳制备和电源洗脱。获得一种具有纤溶性的蛋白酶;该蛋白酶由3个亚基组成,分子量分别为23KD,SSKD,19KD,全酶分子量约为64KD;经纤维蛋白平板测定表明,该酶既具有纤溶酶作用,又具有激活纤溶酶原的作用。     

纳豆激酶基因的克隆和高效表达

为了克隆纳豆激酶(Nattokinase,NK)基因,实现纳豆激酶在大肠杆菌中的表达,并对其表达条件进行研究,首先以从枯草芽孢杆菌中提取的基因组DNA为模板,通过PCR扩增包括信号肽、前导肽、成熟肽序列的前纳豆激酶原基因,将其克隆到载体pET28a中,构建重组质粒pET28a-NK,成功转化大肠杆菌BL21(DE3);然后优化影响该基因表达的温度、时间和IPTG添加量等因素。结果表明,重组菌株BL21(DE3)-NK在20℃下培养、IPTG添加量为0.4 mmol·L-1、培养20 h时表达产物的纤溶活性最大,可达到81.73 U·mL-1,SDS-PAGE检测观察到1条38 kDa的蛋白条带,与预期相符。     

W-15菌株产生的纤溶酶蛋白的提取与纯化

为从微生物中获取溶栓药物,从土壤、豆豉中获得产纤溶酶活性高的1株菌株,命名为W-15。经检测,发酵上清液中纤溶活性的蛋白酶分子质量约为36 kDa,酶的比活为1 571 UK/mg。