肉制品中羊源性成分PCR检测方法的建立及其应用

根据羊特异性线粒体DNA片段,设计合成一对引物,并以生、熟羊肉为材料,建立了肉制品中羊源性成分的PCR检测方法,并用于生、熟羊肉的鉴定。PCR扩增产物DNA片段大小为295 bp。用Sau3AⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定,酶切产物为204 bp和91 bp。PCR产物和酶切产物的片段大小与预期目标相符,其检测灵敏度达到0.225 pg DNA。合成的羊源性DNA引物可以扩增出羊肉的目的 DNA片段,而对马、狗、驴、兔和猪等14种动物DNA无扩增效果。利用该法对83份羊肉制品进行鉴定,检出率为100%。结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定。     

房山区4种动物源性成分PCR检测试验

本研究利用牛、羊、猪、鸡线粒体mtDNA中保守序列16s rRNA,设计一对动物的通用引物,检测了含有动物源性成分的样品,同时设计了针对牛、羊、猪、鸡mtDNA中的保守序列,选择4对特异性引物,扩增得到目的片段大小分别为271 bp、274 bp、212 bp和266 bp。利用通用引物,优化了PCR反应体系及其反应条件,建立了从未知样品中快速获取动物源性成分检测的PCR方法;利用牛、羊、猪、鸡特异性引物,建立了PCR方法快速鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法。     

饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR检测方法及其应用

 【目的】建立鉴定饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR方法,进一步完善现有的动物源性饲料检测方法。【方法】根据牛、羊、猪、鸡、鱼以及马的mtDNA的16S rRNA基因序列选用了一对通用引物,初步检测出含有动物源性成分的样品;然后针对牛、羊、猪、鸡4种动物线粒体mtDNA中的保守序列,分别选用了4对特异性引物对检测出的样品进行PCR扩增,扩增的目的片段大小分别为271、274、149和266 bp。【结果】通过利用通用引物、优化PCR反应体系及其条件,建立了从未知样品中简便而快速的检测出是否含有动物源性成分的PCR方法;利用所选的针对不同动物的特异性引物,建立了鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法,此方法最低检测限可达0.1%。【结论】建立的检测饲料中动物源性成分的方法操作简便,价格低廉,结果准确,可靠,可作为饲料中动物源性成分的鉴定方法之一。     

利用多重PCR技术检测羊肉中掺杂狐狸肉的方法研究

本研究根据山羊、绵羊和狐狸线粒体16S rRNA基因间序列差异,设计特异性引物,其扩增片段大小分别为401、450 bp和300 bp,从而可在一个PCR反应中同时鉴别山羊、绵羊和狐狸三种源性成分,检测灵敏度高。     

肉中猪源性成分Real-time PCR定量检测技术

【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA,根据微卫星DNA核酸序列设计引物,对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增,通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列,设计特异性引物和探针,建立猪源性成分Real-time PCR检测方法,采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量,计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA（Accession EF172428）,根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带,其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25 μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分,百分误差分别约为1.32%和1.06%—7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。     

牛早期胚胎性别鉴定的分子生物学方法研究

根据牛SRY基因序列设计合成了2对嵌套式引物作为公牛特异性引物,同时根据牛β珠蛋白基因(HBB)序列设计了1对引物作为内参照引物,建立了巢式PCR反应体系。对50头母牛和30头公牛DNA样品的检测表明,母牛只能扩增出558 bp的HBB基因片段,而公牛则可以扩增出558 bp的HBB基因片段和219 bp的SRY基因片段,其鉴定结果与实际性别一致。同时,以微量的卵母细胞和精子细胞为模板对该反应体系的灵敏性进行了检验,结果表明,该反应体系可对10个细胞水平进行准确鉴定。     

虎源流感病毒RT-PCR检测方法的建立及其应用研究

为临床上能快速诊断虎流感,通过对已分离获得的虎源H5N1流感病毒和GenBank中报道的A型H5N1亚型流感病毒的NP、HA、NA序列,设计合成各个基因的特异性PCR扩增引物和A型流感病毒通用反转录引物。通过优化反应体系及条件,建立一步法可同时扩增出3个基因的联合RT-PCR检测方法。将该方法用于临床病料检测,并与电镜负染、HA/HI及病毒分离等方法进行比较。结果,NP、HA、NA基因的扩增片段大小分别为464bp、581bp、173bp,其检测的敏感性约100个TCID50。该方法的检出率和病毒分离结果相符,高于电镜负染和HA/HI试验。结果显示,该方法可用于虎源流感病毒的临床或实验室检测。     

支气管败血波氏杆菌PCR检测方法的建立和应用

根据支气管败血波氏杆菌ptxA基因设计1对引物,扩增特异的872 bp核酸片段,建立了应用PCR检测支气管败血波氏杆菌的方法.特异性试验结果表明,3株支气管败血波氏杆菌参考菌株均能扩增出872 bp特异性的核酸片段,兔源性的大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄菌的扩增结果均为阴性.敏感性试验结果表明,PCR的最低检出限量为210个支气管败血波氏杆菌.利用建立的PCR检测方法对22株从山东省泰安地区某兔场采集的疑似兔支气管败血波氏杆菌病病兔鼻黏液棉拭子进行检测,结果19株为阳性.并同时进行普通血清学方法和细菌学方法,对检测结果进行了比较,结果显示,PCR方法阳性检出率高于其他检测方法.     

黄曲霉的快速分子检测

黄曲霉Aspergillus flavus是一种广泛存在的致病真菌,早期准确检测黄曲霉并加以控制是减少黄曲霉毒素产生的有效措施。本研究利用真菌通用引物ITS1/ITS4扩增黄曲霉转录间隔区并进行克隆测序,通过序列比对,设计1对黄曲霉特异性引物S1/X2,由此建立的PCR检测体系对包括黄曲霉在内的5种曲霉菌及其他17种不同的真菌、细菌基因组DNA进行扩增,结果只有不同来源的黄曲霉菌株能扩增出334bp的特异性条带,而其余参试菌株均无扩增产物,其检测灵敏度在DNA水平上可达到280fg。该检测体系能从自然发病的花生或玉米组织中扩增到334bp的特异片段,实现对黄曲霉的快速可靠检测。     

用反转录-聚合酶链反应检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的研究

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型毒株的基因序列设计了一对特异性引物P1/P2,扩增的片段为550bp,根据欧洲型毒株设计了一对特异性检测引物P3/P4,扩增的片段为433bp,建立PRRSV的RT-PCR的检测与血清型鉴别方法。特异性试验表明,这2对引物均不能扩增其他常见的繁殖障碍相关病毒的RNA或DNA。敏感性试验表明,这2对引物可以分别到检测10-5TCID50和10-4TCID50的病毒含量。利用该方法对重庆、四川某些猪场中临床上疑似为PRRS的20份送检组织样品进行检测,只有引物P1/P2能扩增出与预期大小相符的RT-PCR产物;其中有15份样品呈PRRSV阳性结果,阳性率为75%,说明送检的样品感染的PRRSV为美洲型。试验结果表明该方法快速检测病料组织中PRRSV是可行的,是临床上对PRRS进行快速诊断和分子流行病学调查的实用方法。     

应用分子生物学方法快速检测番茄溃疡病菌的研究

根据番茄溃疡病菌的tomA基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应。结果,番茄溃疡病菌的PCR产物出现301bp的特异性扩增条带,而非番茄溃疡病菌均未出现扩增条带,证明这对引物具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将分离的番茄溃疡病菌做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度。结果表明,此体系可检出106CFU/mL番茄溃疡病菌菌液提取的模板。     

应用分子生物学方法快速检测番茄溃疡病菌的研究

根据番茄溃疡病菌的tomA基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应。结果,番茄溃疡病菌的PCR产物出现301bp的特异性扩增条带,而非番茄溃疡病菌均未出现扩增条带,证明这对引物具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将分离的番茄溃疡病菌做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度。结果表明,此体系可检出106CFU/mL番茄溃疡病菌菌液提取的模板。     

芒果畸形病的巢式PCR检测

建立了检测芒果畸形病的有效方法。利用Fusarium proliferatum的钙调蛋白基因序列设计外侧引物PRO1/PRO2和内侧引物O1/O2,采用引物PRO1/PRO2可以从芒果畸形病病原菌基因组中扩增出527 bp的特异性基因片段,采用引物O1/O2可获得477 bp的基因片段。巢式PCR的检测灵敏度达5×10-5ng/μL,是常规PCR的100倍。此法具有良好的特异性和检测灵敏度,为芒果畸形病的早期诊断和及时有效的防治提供技术方法和理论依据。     

玉米孢囊线虫SCAR-PCR快速分子检测技术

【目的】 玉米孢囊线虫（Heterodera zeae）为孢囊线虫属定居型半内寄生线虫,可侵染多种禾本科作物的根部,玉米孢囊线虫的发生和传播扩散将会对我国玉米生产造成严重威胁。本研究旨在建立玉米孢囊线虫的快速分子检测体系,以期从近缘属种可以准确地检测出玉米孢囊线虫,为玉米孢囊线虫的监测预警和防控打下技术基础。【方法】 从我国河南、河北、甘肃、山东、湖南、广西和北京共收集20个玉米孢囊线虫近缘属种群体作为供试线虫;选取13条含有10个碱基的随机引物,采用RPAD技术对供试孢囊线虫进行多态性分析,筛出玉米孢囊线虫特异性RPAD片段,并将其转化为玉米孢囊线虫SCAR-PCR引物;采用PCR方法测试玉米孢囊线虫特异性引物的准确性以及检测技术体系的稳定性、灵敏度和实效性。【结果】 通过RAPD比对分析,发现随机引物OPA03能在玉米孢囊线虫基因组DNA中扩增出一条468 bp的特异性片段;将该片段回收测序,根据片段序列信息,利用Primer 5.0设计一对特异性引物HzF1/HzR1;特异性检测结果表明,HzF1/HzR1仅在玉米孢囊线虫群体中扩增出大小为393 bp的特异性片段,其他5种16个孢囊群体（禾谷孢囊线虫、菲利普孢囊线虫、大豆孢囊线虫、旱稻孢囊线虫和甜菜孢囊线虫）和4个其他种群（水稻干尖线虫、马铃薯腐烂茎线虫、落选短体线虫和咖啡短体线虫）均没有扩增出目的条带;以含有玉米孢囊线虫的混合种群孢囊DNA为模板时,特异性引物HzF1/HzR1也能扩增出来单一明亮的393 bp的特异片段,而不含玉米孢囊线虫的混合种群不能扩增出该片段;该体系实现了玉米孢囊线虫准确、稳定的检测目的;对建立的玉米孢囊线虫快速检测技术体系灵敏度和实用范围测试,表明该检测体系对玉米孢囊线虫单个孢囊和单条幼虫均有灵敏的检测能力,检出值不低于1/2 000个孢囊和1/80条2龄幼虫。【结论】 本研究建立的玉米孢囊线虫SCAR-PCR快速分子检测技术,可用于玉米孢囊线虫单一样本和混合种群的快速检测,对玉米孢囊线虫的孢囊和2龄幼虫均有灵敏的检测能力,检测引物特异性强,检测方法便捷稳定,灵敏度高。     

基于多重PCR技术同时检测肉制品中6种动物源性成分

为建立一种检测肉制品中6种动物源性成分(牛、羊、鸡、猪、鸭和驴等)的多重PCR方法,比较了3种DNA提取方法,设计筛选了6对引物并对其特异性进行验证,同时对影响多重PCR扩增效率的因素(引物比例、退火温度和镁离子浓度等)进行优化。结果表明:试剂盒法为最佳的DNA提取方法;多重PCR法最优反应条件:引物比例为牛∕羊∕鸡∕鸭∕猪∕驴=2∕1∕1∕0.5∕1∕1,退火温度为58.6℃,镁离子浓度为3 mmol∕L,各动物源性成分DNA最低检出限为0.1 ng。该方法具有特异性强、灵敏度高、简单快捷等优点,可用于肉制品中6种动物源性成分的同时检测。     

应用PCR法检测向日葵茎溃疡病菌的研究

[目的]设计出向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi M.Muntanola - Cvetkovic)的特异性引物,建立该病菌PCR快速检测方法.[方法]用真菌通用引物ITS4/ITS5对向日葵茎溃疡病菌进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆、酶切分析和测序,用DNAMAN软件设计出检测该病菌的特异性引物PHDF1和PHDF2,优化PCR反应体系.[结果]PCR反应体系为:25 mM MgCl2 2.4 μL,10 mM dNTP 0.3 μL,10 uM引物各1.5 μL,模板7 ng,最佳退火温度61.6C,建立了该病菌PCR检测方法.[结论]应用该方法检测供试的13个菌株,该对引物可以准确的将向日葵茎溃疡病菌与其他拟茎点霉属的真菌区分开来,该病菌的PCR扩增片段为326 bp.     

DP -305423转基因大豆PCR检测方法研究

根据DP- 305423外源插入片段与植物基因组序列设计特异性引物,以leetin基因(118 bp)作为内参照基因,筛选最佳引物并对反应程序和反应体系进行优化,最终建立转基因大豆DP - 305423转化体特异性定性PCR检测方法.对该方法进行了特异性、灵敏度、稳定性和重复性测试.结果表明:该方法能够特异性检测出DP...     

牛病毒性腹泻病毒巢式RT-PCR检测方法的建立及应用

参照多株不同基因型和基因亚型牛病毒性腹泻病毒(BVDV)5′UTR相对保守的基因序列,设计3对引物,其中1对能够扩增不同基因型BVDV 5′UTR片段(288 bp),另2对分别能够扩增BVDV-1型和BVDV-2型5′UTR片段(195 bp和116 bp)。扩增片段大小与预计片段一致。对PCR反应条件进行优化,建立了一种特异、敏感的RT-nPCR检测方法。敏感性试验表明,敏感性为10-2TCID50/mL。特异性试验表明,对猪瘟兔化弱毒疫苗株、牛轮状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒的检测结果均为阴性。通过对新疆部分地区无BVD临床症状的牛场208份奶牛血样检测,阳性率为50.43%,表明该方法具有快速、简便、特异性强和灵敏度高等特点,可以作为BVDV隐性感染临床诊断的有效方法。     

PCR技术在印度腥黑穗病菌检测和鉴定中的应用

利用2对小麦印度腥黑穗病菌（Tilletia indica Mitra)特异性引物（Tin3/Tin4,F3／R1）和2对黑麦草腥黑穗病菌T.walkeri特异性引物（Tin7/Tin8,Tin11/Tin4)建立快速鉴定T.indica及其近似种T.walkeri的PCR程序。引物Tin3/Tin4,F3/R1可特异性扩增T.indica分别得到415bp和498bp产物,扩增T.walkeri无产物;引物Tin/Tin8,Tin11/Tin4可特异性 扩增T.walkeri得到391bp和415bp产物,扩增T.indica无产物。4对引物扩增T.horrida、T.controversa和T.laevis无产物。产物片段的测序验证了PCR反应的可靠性。为进口粮检疫中T.indica的鉴定提供了快速、简便、实用的PCR诊断技术。     

检疫性真菌病害向日葵黑茎病菌和茎溃疡病菌的三重PCR分子检测

向日葵黑茎病菌Leptosphaeria lindguistii和向日葵茎溃疡病菌Diaporthe helianthi是向日葵上寄生的2种重要的检疫性真菌病害.针对这2种致病菌,目前国内外已有形态学鉴定和危害的研究报道以及向日葵黑茎病菌的ITS序列分析和RFLP初步研究,但未见有2种病原菌同步分子检测的报道.本研究首先通过培养,观察比较了2种病原菌的菌落和形态特征.发现前者菌落絮状,分生孢子器深褐球型,分生孢子为单胞肾形;后者菌落短绒毛状,分生孢子器柠檬黄,分生孢子为线型.通过油菜黑茎病菌L.biglobosa的肌动蛋白基因设计供试材料的通用引物act F/act R,扩增产物片段约为720 bp,然后采用真菌通用引物ITS1/ITS4和引物act F/act R,针对所有菌株菌丝DNA进行ITS区域和Actin基因PCR扩增,经克隆测序结果比对分析发现,向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的ITS区域存在极高的相似度.因此,依据Actin基因特异位点分别设计出向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌的特异引物LLF/LLR和DHF/DHR.在同一PCR管中3组引物(ITS1/ITS4,LLF/LLR和DHF/DHR)经优化体系后,ITS1/ITS4扩增序列作为所有菌株菌丝基因组DNA提取模板的质量监控,针对向日葵黑茎病菌和向日葵茎溃疡病菌单一模板的ITS区域与Actin基因中的两个位点同时进行三重PCR扩增.利用此方法检测向日葵黑茎病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和255 bp的Actin基因的特异扩增带,向日葵茎溃疡病菌出现580 bp的ITS保守区扩增片段和394 bp的Actin基因特异扩增带.所有菌株均未见非特异性片段的干扰.此三重PCR检测体系的建立为此两种检疫性真菌病害的同步分子检测提供了特异方法.