应用分子生物学方法快速检测番茄溃疡病菌的研究

根据番茄溃疡病菌的tomA基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应。结果,番茄溃疡病菌的PCR产物出现301bp的特异性扩增条带,而非番茄溃疡病菌均未出现扩增条带,证明这对引物具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将分离的番茄溃疡病菌做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度。结果表明,此体系可检出106CFU/mL番茄溃疡病菌菌液提取的模板。     

番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测方法研究

根据番茄溃疡病菌ITS(16S~23SrDNA间隔区)基因序列,设计并合成了荧光PCR检测引物(Fan1和Fan2)及特异性检测探针(Fanprobe),对番茄溃疡病菌和非番茄溃疡病菌的标准菌株实时荧光PCR反应。结果表明,番茄溃疡病菌PCR产物出现强烈的特异杂交信号,而非番茄溃疡病菌均未出现特异荧光信号,证明这对引物及探针具有番茄溃疡病菌鉴定特异性。将番茄溃疡病菌DNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果表明,此体系可检出52.3 fg/μL的模板。     

番茄溃疡病菌分子检测技术

对中国三类检疫性有害生物番茄溃疡病菌(Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis)进行PCR检测方法的研究。利用1对特异性引物ClaF1ClaR2,对5个番茄溃疡病菌进行特异性扩增,得到了一段长250bp的PCR产物,参试的其他棒形细菌以及其他属的植物病原细菌均无扩增产物。该检测方法特异性强、灵敏度高,在50pg的模板DNA浓度下还能检测到很强的条带。利用此引物可以检测到1×105个菌体。     

利用PCR技术快速检测玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii subsp.stewartii)

根据玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartiisubsp.stewartii)ITS基因序列,设计并合成了特异性PCR检测引物,对玉米细菌性枯萎病菌和非玉米细菌性枯萎病菌的标准菌株进行了PCR扩增反应.结果显示,玉米细菌性枯萎病菌的PCR产物出现301 bp的特异性扩增条带,而非玉米细菌性枯萎病菌均未出现扩增条带;其PCR检测的灵敏度为612 pg/μL.因此PCR技术是一种特异、灵敏、快速检测玉米细菌性枯萎病菌的方法.     

应用PCR法检测向日葵茎溃疡病菌的研究

[目的]设计出向日葵茎溃疡病菌(Phomopsis helianthi M.Muntanola - Cvetkovic)的特异性引物,建立该病菌PCR快速检测方法.[方法]用真菌通用引物ITS4/ITS5对向日葵茎溃疡病菌进行PCR扩增,将扩增产物进行克隆、酶切分析和测序,用DNAMAN软件设计出检测该病菌的特异性引物PHDF1和PHDF2,优化PCR反应体系.[结果]PCR反应体系为:25 mM MgCl2 2.4 μL,10 mM dNTP 0.3 μL,10 uM引物各1.5 μL,模板7 ng,最佳退火温度61.6C,建立了该病菌PCR检测方法.[结论]应用该方法检测供试的13个菌株,该对引物可以准确的将向日葵茎溃疡病菌与其他拟茎点霉属的真菌区分开来,该病菌的PCR扩增片段为326 bp.     

应用复合RT-PCR同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒

将烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus)和番茄环斑病毒(Tom ato ringspot virus)的CP基因及RNA2基因序列引物,合成特异性RT-PCR检测引物,对烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应,结果显示,感染了烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的植物组织的PCR产物均出现600 bp和470 bp特异性扩增条带,而其他病毒均未出现扩增条带,证明这两对引物具有烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒和番茄环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果显示,此体系最低可检出烟草环斑病毒和番茄环斑病毒提取的RNA模板浓度为234 pg/μl和264 pg/μl。表明,复合RT-PCR是一种可同时检测烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的快速检测方法。     

双重PCR技术检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌方法的建立

 【目的】利用双重PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）和黑胫病菌（Pectobacterium atroseptica）。【方法】根据GenBank上发表的马铃薯环腐病菌pCS1质粒上纤维素酶A基因序列,对比近缘种及马铃薯上几种重要病原菌的核苷酸序列,设计并合成了1对特异性引物CMS1/CMS2,将设计的引物与已发表的PCR检测马铃薯黑胫病菌特异性引物ECA1f/ECA2r结合,经过条件优化后,建立了双重PCR体系。【结果】利用引物CMS1/CMS2扩增出了1条913 bp的马铃薯环腐病菌特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达100 fg•μL-1,在细菌数上达105 CFU•mL-1。利用双重PCR体系对马铃薯环腐病菌和黑胫病菌进行扩增,可获得913和690 bp的2条特异性条带。检测灵敏度在DNA水平上达600 fg•μL-1,在细菌数上达5×105 CFU•mL-1。【结论】成功建立了双重PCR检测马铃薯环腐病菌和黑胫病菌技术体系,该技术能够同时快速可靠地检测出马铃薯环腐病菌和黑胫病菌。     

利用PCR技术特异性检测人参恶疫霉菌等6种疫霉菌

为了建立能同时检测人参恶疫霉菌（Phytophthora cactorum）等6种疫霉菌的快速检测方法,以期为病害的发生预测和早期诊断技术提供依据。通过比较基因组学分析,根据恶疫霉菌等疫霉菌属的6个种共有基因设计引物,通过PCR方法筛选特异性引物,并对引物的特异性、灵敏度和应用可行性进行验证。结果表明：筛选到了1对用于检测疫霉属6种病菌的常规PCR特异性引物YB-00394F/YB-00394R,采用优化的PCR扩增体系和反应条件进行扩增,筛选到的特异引物分别从疫霉属的6个种中扩增出386 bp大小的条带,而其他非疫霉属真菌无扩增条带。常规PCR法对人参恶疫霉菌基因组DNA检测的灵敏度为100 fg/μL,应用PCR方法成功快速的在62份植物样本和95份土壤样本中检测到了目标疫霉病菌。建立的常规PCR方法可以快速灵敏地检测6种疫霉属的真菌。     

番茄溃疡病菌LAMP快速检测方法的建立

以SYBR Green I为指示剂,建立了番茄溃疡病菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。根据番茄溃疡病菌特异的核糖体转录间隔区序列设计了4条引物进行LAMP扩增,通过对体系中各成分进行优化,最终确定25μL反应体系中模板200ng,MgSO4的适宜浓度为3.0mmol/L,Bst DNA聚合酶2U,dNTPs的适宜浓度为0.3mmol/L,外引物与内引物之比为1∶3时扩增效果较好,在65℃最佳反应时间为40min。在优化的体系条件下,获得的反应产物经SYBR Green I染色后,肉眼观察检测灵敏度可达到50CFU/mL,且对番茄溃疡病菌的检测具有高度的特异性。结果表明,该方法快速、准确、灵敏、特异,具有良好的实用性。     

柑橘溃疡病菌PCR快速检测技术研究初报

应用柑橘溃疡病菌独有的保守基因设计并合成了引物对,建立柑橘溃疡病菌PCR检测技术.PCR检测结果表明,来源于不同产地的病菌菌株均可扩增出靶标带,而水稻白叶枯病菌不能扩增出靶标带;2×10~2×105 个·ml-1的溃疡病病菌悬浮液也均可扩增出靶标带,说明该PCR技术具有很强的特异性和检测灵敏度.研究结果也表明,来源于福建、四川和安徽的柑橘溃疡病菌具有同源性.     

番茄溃疡病菌检测技术研究进展

概述了几种常见的番茄溃疡病菌检测技术,包括血清学检测技术、PCR技术、实时荧光PER技术、Rep—PCR技术、核酸分子杂交检测技术,并对番茄溃疡病检测技术进行了展望。     

番茄溃疡病一步法快速检测技术研究

对番茄细菌性溃疡病菌进行种子带菌的模拟检测试验.对用菌液处理过的种子进行简单抽提和纯化,不经过DNA提取而以抽提和纯化的病原菌为模板直接进行一步法PCR检测,对纯菌液Direct-PCR 最低检出限为2 600个细菌/ml,而Nested-PCR最低检出限可达到13个细菌/ml;对种子提取液,Direct-PCR不能检出,而Nested-PCR最低检出限可达到3×105个细菌/ml.一步法Nested-PCR可在12 h内对番茄种子携带的番茄溃疡病菌进行准确的定性鉴定.并且方法方便快速,成本低,灵敏度高,适用于种子携带番茄溃疡病菌的快速鉴定.     

基于锁式探针的番茄溃疡病菌实时荧光PCR快速检测

【目的】从口岸进境番茄种子中检测番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,CMM）,一直以来都受检测周期的限制,快速、特异地从种子中检测该病原细菌需要新的方法。研究在锁式探针扩增方式上,选择连接酶依赖的PCR扩增方式,并结合实时荧光PCR技术,旨在建立番茄溃疡病菌基于锁式探针技术的实时荧光PCR快速检测方法,为口岸番茄种子快速检疫提供技术支持。【方法】根据番茄溃疡病菌的一段特异基因Pat-1序列,设计锁式探针的T1和T2臂,使之与CMM的特异性片段碱基序列互补,再按照锁式探针的设计原则设计锁式探针和扩增引物以及荧光探针。试验时,先将锁式探针与CMM以及参照菌株的DNA模板在DNA连接酶作用下分别进行环化连接,再用核酸外切酶Ⅰ和核酸外切酶Ⅲ消化未环化的线性锁式探针,最后以环化的锁式探针为模板,在扩增引物的作用下进行实时荧光PCR试验。建立CMM基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法,分别比较该方法的特异性和灵敏度与常规PCR方法的差异,并用该方法对收集的来自日本、韩国和中国台湾的番茄种子以及国内采集的共45份样品进行检测。【结果】基于锁式探针技术的实时荧光PCR检测方法能够从供试的菌株中特异性地检出CMM,在供试的10种菌株中,只有靶标细菌能被特异性地检测到阳性,空白对照和其他参试菌株均没有荧光信号的增加,检测为阴性。比较该检测方法与常规PCR方法,其特异性和常规PCR方法一致。该检测方法检测灵敏度高,DNA最低浓度检测为50 fg•μL-1,而常规PCR方法检测DNA最低浓度为5 pg•μL-1,灵敏度高于常规PCR两个数量级。对收集的样品进行检测,结果显示,45份样品中共有5份样品CMM检测结果为阳性,分别是日本的番茄种子样品2份（编号Jap1214、Jap1102）,永泰采集的样品2份（编号为Yongt1001、Yongt1002）和闽清采集的样品1份（编号为Minq1001）。【结论】建立的基于锁式探针技术的荧光PCR方法具有高度的特异性和灵敏度,应用该检测方法对收集的进境番茄种子进行检测,可以直接从番茄种子中检测到CMM,该方法适合口岸番茄种子CMM的快速检测,有较好的口岸检疫实际应用价值。     

番茄细菌性溃疡病研究进展

 根据国内外近年来番茄溃疡病的研究概况,对番茄溃疡病的历史、主要症状、病原菌的分类地位及生物学特性、病原菌的分离、检测和鉴定技术、病害的田间发生、流行条件及防治方法进行了综述,分析了我国加入世界贸易组织后实施《卫生与植物卫生措施协定》以及农产品安全条例等,认为做好番茄溃疡病风险性分析、监测国际种子贸易传入该病害的可能性非常重要,同时提出了今后加强番茄溃疡病研究的主要方向。     

A multiplex PCR method for detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis with co-amplification of its host DNA

A multiplex PCR assay system was developed for the detection of Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis (Cmm), which combined two tests in one reaction mixture. Cmm-specific primers PSA-4/PSA-R and Solanum lycopersicum-specific primers NS-7-F/NS- 8-R (internal PCR control primer) were combined in one PCR reaction mixture with Cmm and plant DNA as template. The primer sets could amplify the target product successfully. Different combinations and concentrations of primers and annealing temperatures were tested, respectively. The detection level of the optimized multiplex PCR assay was up to 5×10² cfu·mL⁻¹. To verify the applicability of this system, it was employed to detect Cmm in tomato seeds and plantlet samples. Seeds mixed with Cmm and diseased plantlets were detected successfully. The multiplex PCR system will avoid false-negative results and provide a reliable method for the detection of Cmm.     

番茄溃疡病病原细菌对5种药物敏感程度的研究

目前国内鲜有关于番茄溃疡病菌对药物敏感程度的研究报道,本研究针对19株溃疡病菌对5种药剂的敏感性进行了测定,结果表明,19株菌全部对络氨铜和噻菌铜表现耐药,73.68%的菌株对氢氧化铜表现耐药,78.95%的菌株对0.1%溴硝醇溶液表现高度敏感,94.74%的菌株对链霉素表现高度敏感,说明目前使用链霉素防治番茄溃疡病的效果要远远好于铜制剂和溴硝醇;抗药菌株的出现,说明溃疡菌对药剂已经产生了抗性,对铜制剂的抗药性最强。     

云南省马铃薯环腐细菌鉴定

 报道对云南省陆良县引起马铃薯植株萎蔫和块茎维管束环状腐烂的病原菌从致病性、形态学、培养形状、运动性、生理生化测定等方面进行的鉴定,确定该菌为马铃薯环腐菌（Clavibacter michiganensis subsp.sepedonicus）。