饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR检测方法及其应用

 【目的】建立鉴定饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR方法,进一步完善现有的动物源性饲料检测方法。【方法】根据牛、羊、猪、鸡、鱼以及马的mtDNA的16S rRNA基因序列选用了一对通用引物,初步检测出含有动物源性成分的样品;然后针对牛、羊、猪、鸡4种动物线粒体mtDNA中的保守序列,分别选用了4对特异性引物对检测出的样品进行PCR扩增,扩增的目的片段大小分别为271、274、149和266 bp。【结果】通过利用通用引物、优化PCR反应体系及其条件,建立了从未知样品中简便而快速的检测出是否含有动物源性成分的PCR方法;利用所选的针对不同动物的特异性引物,建立了鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法,此方法最低检测限可达0.1%。【结论】建立的检测饲料中动物源性成分的方法操作简便,价格低廉,结果准确,可靠,可作为饲料中动物源性成分的鉴定方法之一。     

同步检测动物源性成分的四重PCR的条件优化和检出限分析

为建立肉制品中牛、羊、猪、鸡动物源性成分的快速高效多重PCR检测方法,利用4对牛、羊、猪和鸡源特异性PCR引物(靶基因序列来源于线粒体基因组)对多重PCR反应条件进行优化,并确定该检测方法的检出限。结果表明:四重PCR方法最佳反应条件为牛、羊、猪、鸡源特异性引物浓度分别为0.16μmol∕L、0.40μmol∕L、0.16μmol∕L、0.16μmol∕L,退火温度58℃,退火时间45 s,循环次数40。在最佳反应条件下,所建立的牛、羊、猪和鸡4种动物源性成分四重PCR的g DNA检出限为25 pg。应用优化后的四重PCR方法对20份市售肉制品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性,结果与现行标准的检测结果一致,掺假率达45%。本试验为该4种动物源性成分的快速检测提供了技术支撑。     

肉中猪源性成分Real-time PCR定量检测技术

【目的】建立一种快速、准确的肉中猪源性成分定量检测方法。【方法】首先从GenBank数据库中筛选猪特异性的微卫星DNA,根据微卫星DNA核酸序列设计引物,对常见10种动物基因组DNA进行PCR扩增,通过有无扩增产物判断筛选的微卫星DNA对猪源性成分的特异性。然后根据微卫星DNA核酸序列,设计特异性引物和探针,建立猪源性成分Real-time PCR检测方法,采用双标准曲线分别对猪源性成分和总动物源性成分进行定量,计算猪源性成分的百分含量。【结果】筛选到猪特异性微卫星DNA（Accession EF172428）,根据其序列设计的引物SEQ-sus2-F/R只能从猪基因组DNA中扩增出目的条带,其他动物的基因组均无目的条带扩增。建立的Real-time PCR检测方法灵敏度为0.02 ng/25 μL反应体系。该方法能够准确检测出混合DNA样品中猪源性成分和混合肉样品中猪源性成分,百分误差分别约为1.32%和1.06%—7.12%。【结论】本研究利用Real-time PCR技术建立的定量猪源性成分的检测方法可以用来检测猪源性成分在混合样品中的百分含量。     

基于多重PCR技术同时检测肉制品中6种动物源性成分

为建立一种检测肉制品中6种动物源性成分(牛、羊、鸡、猪、鸭和驴等)的多重PCR方法,比较了3种DNA提取方法,设计筛选了6对引物并对其特异性进行验证,同时对影响多重PCR扩增效率的因素(引物比例、退火温度和镁离子浓度等)进行优化。结果表明:试剂盒法为最佳的DNA提取方法;多重PCR法最优反应条件:引物比例为牛∕羊∕鸡∕鸭∕猪∕驴=2∕1∕1∕0.5∕1∕1,退火温度为58.6℃,镁离子浓度为3 mmol∕L,各动物源性成分DNA最低检出限为0.1 ng。该方法具有特异性强、灵敏度高、简单快捷等优点,可用于肉制品中6种动物源性成分的同时检测。     

鹅源性成分PCR检测方法的建立

[目的]建立一种检测鹅源性成分的PCR方法。[方法]以15种动物的DNA为模板,利用鹅的特异性引物进行PCR反应,PCR产物用1．4％的琼脂糖凝胶电泳检测并测序,检测引物的特异性和敏感性。[结果]通过PCR反应从鹅样品中扩增到了304bp的目的片段,其他物种火鸡、鸭、鸽鹑、鸵鸟、鸽子、鸡、马、牛、羊、猪、狗、驴、猫、鱼和空白对照则无目的片段,表明该引物的特异性良好。鹅组织PCR产物的核苷酸序列与GenBank中检索到的相应序列基本符合,相似性为98％;PCR检测方法的检测灵敏度为0．01％。[结论]该PCR检测方法特异性强、准确性好、灵敏度高、可重复性好,为明确食品与饲料的成分和来源,预防禽流感的传播提供了有效的分子生物学捡测方法.     

肉制品中羊源性成分PCR检测方法的建立及其应用

根据羊特异性线粒体DNA片段,设计合成一对引物,并以生、熟羊肉为材料,建立了肉制品中羊源性成分的PCR检测方法,并用于生、熟羊肉的鉴定。PCR扩增产物DNA片段大小为295 bp。用Sau3AⅠ限制性内切酶进行酶切鉴定,酶切产物为204 bp和91 bp。PCR产物和酶切产物的片段大小与预期目标相符,其检测灵敏度达到0.225 pg DNA。合成的羊源性DNA引物可以扩增出羊肉的目的 DNA片段,而对马、狗、驴、兔和猪等14种动物DNA无扩增效果。利用该法对83份羊肉制品进行鉴定,检出率为100%。结果表明,该法快速简便,且具有较高的特异性和敏感性,可用于市售牛肉制品中牛源性成分的鉴定。     

基于TaqMan PCR鉴定猪源性成分的引物和探针研发

为了研发具有自主知识产权的猪源性成分检测的引物和探针,比对猪、牛、羊、马、鸡、鸭、兔、鹅等8种动物的线粒体基因组,筛选并设计猪特异性的引物和探针组合进行荧光定量PCR。研究结果表明,所研发的猪源性成分检测的引物和探针仅对猪相关DNA模板有典型扩增曲线,对其他动物来源的DNA模板无扩增,具有高度的猪源性特异性。灵敏度实验表明,利用此引物和探针的检测方法具有高度的灵敏度,可达1 pg级。肉制品中猪源性定量检测实验说明此方法具有较好的定量检测能力。此引物和探针组合适用于猪源性食品和农畜产品的检验检测。     

3种动物性食品的分子生物学鉴定方法研究

【目的】建立一种快速、高效、准确的动物源性食品材质的鉴定方法。【方法】采用PCR方法扩增猪、羊、牛动物组织mtDNA的COⅠ基因,对PCR扩增片段进行测序并构建系统发生树;以HinfⅠ酶为内切酶,对3种样品的COⅠ基因进行聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析。【结果】对测序结果进行多重序列比对发现,猪、羊、牛COⅠ基因的碱基差异为19.0%~25.9%,物种内的碱基差异仅为0.1%~1.6%。猪、羊、牛COⅠ基因PCR扩增片段经HinfⅠ酶切后的长度依次为40,411,449 bp;144,376,381 bp和46,377,479 bp,限制性片段长度具有物种特异性。【结论】COⅠ基因的序列及PCR-RFLP分析,可用于猪、牛、羊动物源性食品的材质鉴定。     

肉制品中驴源性成分PCR方法的建立及应用

建立了驴源性成分的快速分子检测方法,确立了1对驴源性成分的特异性引物HorseF/HorseR,扩增目的片段的长度是294 bp,经验证引物对驴源性成分的特异性良好,确立了PCR反应的最佳反应体系和最优反应条件。反应体系的检测灵敏度是13.7 pg/μL。扩增片段经AluⅠ酶切分析确认,所得181、113 bp片段与分析结果一致。利用该方法对市售样品进行检测,检测结果准确。     

利用通用引物检测天然宠物饲料中的动物源性成分

[目的]为天然宠物饲料的快速筛查和种类鉴定提供有效的技术支持.[方法]根据动物线粒体细胞色素b基因序列,设计1对通用引物,建立动物源性成分的检测方法.[结果]通过设计并合成通用引物、优化PCR反应体系及其条件,建立了1种检测样品中动物源性成分的简便、快速PCR方法.该检测方法灵敏度高,最低检测限可达0.001％.[结论]该检测方法操作简便、结果准确、灵敏度高,可作为天然宠物饲料中动物源性成分的鉴定方法之一.     

Development and Application of a PCR Approach for Detection of Bovis, Sheep, Pig, and Chicken Derived Materials in Feedstuff

A PCR method for detection of bovis, sheep, pig, and chicken derived materials in feedstuff was established, and the existing method was improved according to the research on general primer and species-specific primers. First, general primer designed according to 16S rRNA gene sequence of hovis, sheep, pig, chicken, fish, and horse mtDNA was used for primary detection of animal derived materials in feedstuff. Species-specific primers designed according to conserved sequence of mtDNA of bovis, sheep, pig, and chicken were used for amplification of a 271,274, 149, and 266 bp fragment, respectively. Further confirmation of the detection result was then carried out. PCR method for detection of animal derived materials in unknown feedstuff was developed by using general primer, relevant PCR system, and PCR condition. Also a PCR method for detection of each species （bovines, sheep, pig, and chicken） was designed by using our speciesspecific primers. High sensitivity and specificity of our method were confirmed with a minimum detection level of 0.1%. Method for detection of animal derived materials in this research is not only cheap and easy for operation but also precise and reliable results can be obtained. It could be one of the effective methods for the detection of animal derived materials in feedstuff.     

一种快速鉴定羚牛组织的技术研究

羚牛（Budorcas taxicolor）是国家一级重点保护动物,被世界自然保护联盟（International Union for Conservation of Nature,IUCN）列为易危物种,但其被盗猎的行为时有发生。为了在打击盗猎时能够提供快速准确的鉴定证据,基于实时荧光定量PCR技术,通过筛选特异的荧光定量PCR引物,以期准确区分羚牛与鸡、牛、羊、猪等家禽家畜的组织样品。结果表明,引物tk-p3和tk-p5在羚牛肌肉组织中的表达水平显著高于鸡、牛、羊、猪,表明其可以在mRNA水平有效区分羚牛与家禽家畜的肌肉组织。但鉴于组织中mRNA容易降解的特性,进一步在基因组DNA水平进行定量检测,结果表明,引物tk-p3和tk-p5同样在羚牛中的表达水平显著高于鸡、牛、羊、猪。因此,筛选到的两对特异性荧光定量PCR引物tk-p3和tk-p5可用于快速准确地鉴定羚牛组织,为打击羚牛盗猎行为提供有效的技术支撑。     

新疆焉耆地区4种动物源的沙门菌耐药性及耐药基因检测

为探明新疆焉耆地区4种动物(牛、鸡、猪、羊)源沙门菌对临床常用抗菌药物的耐药性及其携带耐药基因的情况,通过选择性培养基和管家基因invA的PCR检测,分离、鉴定沙门菌;采用琼脂稀释法检测其对11种抗菌药物的最小抑菌浓度;在分离株中用PCR的方法检测14种耐药基因。结果表明：共分离出不同动物源沙门菌191株,分离率从高到低依次为牛源(62.0%)、鸡源(28.3%)、猪源(9.0%)和羊源(8.5%);不同动物源沙门菌对被检抗菌药物显示出不同程度的耐药性,鸡源、羊源、猪源、牛源的耐药严重程度依次降低,鸡源沙门菌耐药谱宽,多药耐药在0~3、5~7耐有分布,对四环素和氟苯尼考耐药率在70.0%以上,羊源沙门菌对氨苄西林的耐药率(88.2%)高于其他动物源的,多药耐药以7耐(23.5%)为主,牛源沙门菌对环丙沙星的耐药率(66.1%)高于其他动物源的,多药耐药以4耐(38.7%)为主,不同动物源沙门菌均对磷霉素、亚胺培南和多粘菌素敏感,耐药谱型多样化;不同动物源沙门菌中除qnrS和mcr–1基因未检出外,其余被检耐药基因均有检出,blaCMY–2和tetA基因仅在猪源沙门菌中被检出,不同动物源沙门菌均以同时携带blaTEM、blaOXA、tetB、oqxA、oqxB、aadA2、ant(3")–Ia、aac(6'')–Ib–cr、floR耐药基因为主,牛源沙门菌对以上耐药基因检出率最高,在35%以上,羊源与猪源沙门菌对以上耐药基因检出率在20%左右,鸡源沙门菌对以上耐药基因检出率不到10%。     

利用PCR技术鉴别畜禽肉中禽源性成分研究

为了建立一种快速、特异的禽源性成分检测方法,以线粒体16S r RNA基因序列为靶位点设计鸡、鸽、鹌鹑特异性引物,以常见畜禽肉(包括羊肉、牛肉、猪肉、兔肉、鸽肉、鹌鹑肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉等)DNA为模板,进行PCR扩增和特异性检测。结果表明,筛选的引物能够有效地对动物源性成分进行检测,方便简洁,可快速鉴别畜禽肉食品中含有的鸡源性、鸽源性、鹌鹑源性成分。     

应用两种PCR方法检测饲料中牛、羊源性成分

对普通PCR和实时(realtime)PCR两种方法在饲料中牛、羊源性成分检测中的应用进行了比较。分别设计并合成相应的引物和探针,对饲料中的牛、羊源性成分进行检测。结果表明,用普通PCR最低可以从饲料中检出0.1%的牛、羊源性成分,realtime PCR最低可以从饲料中检出0.01%的牛、羊源性成分。     

食品中4种肉类成分多重PCR的快速鉴别方法

【目的】建立快速可靠的用于食品中4种肉类（猪肉、牛肉、羊肉和鸡肉）成分快速鉴别的通用引物多重PCR（universal primers-multiplex PCR,UP-M-PCR）方法。【方法】使用DNeasy试剂盒提取法、SDS-蛋白酶K法和CTAB-蛋白酶K法分别提取肉类中总DNA,通过比较提取效率和纯度,确定提取肉类中总DNA的方法;基于动物线粒体细胞色素b基因的差异性位点,设计两组各5条长度不同的多重PCR引物,建立并优化多重PCR反应体系,通过电泳检测扩增产物分子量差异实现4种肉类的快速鉴别;应用优化的多重PCR方法对80份市售食品样本进行盲样检测,验证鉴别方法的准确性。【结果】SDS-蛋白酶K法与DNeasy试剂盒提取法的DNA效率显著优于CTAB-蛋白酶K法;在优化的反应条件下,选择特异性高、序列较长的多重PCR引物可有效地进行食品中猪、牛、羊和鸡源性成分的快速鉴定,检测灵敏度达到皮克级DNA;对市售食品样本的鉴别验证了方法的实用价值。【结论】多重PCR方法精确稳定,可用于食品中多种动物源性成分的快速鉴别。     

贵州黑山羊IL-2基因的克隆及序列分析

根据Gen Bank中山羊IL-2基因序列(登录号:NM_001287567)设计一对特异性引物,采用RT-PCR技术从贵州黑山羊外周血淋巴细胞中扩增IL-2基因,并将其克隆到p MD19-T载体上,构建IL-2基因克隆质粒,通过质粒PCR、双酶切和序列测定进行鉴定,对其核苷酸、氨基酸进行了比对分析并绘制系统进化树。结果表明,贵州黑山羊IL-2基因大小为468 bp,编码155个氨基酸。该基因与山羊、绵羊、藏羚羊、蓝牛羚、林麝、猪、牛、猫、大熊猫、犬、人、鼠、鸡等动物的核苷酸一致性在39.6%~100%,氨基酸一致性在26.7%~100%,遗传进化树表明,贵州黑山羊IL-2基因与鸡亲缘关系最远。     

巢式PCR检测油茶根腐病菌的研究

为建立油茶Camellia oleifera根腐病菌层生镰刀菌Fusarium proliferatum的巢式聚合酶链式反应（PCR）快速检测体系．扩增层生镰刀菌核糖体DNA基因间隔序列（ITS）区并测定其序列,比较该序列与GenBank中近似种的ITS序列差异．设计了特异性引物GF1和GR2,利用该对引物与ITS1和ITS4进行巢式PCR扩增检测层生镰刀菌。结果显示,巢式PCR对层生镰刀菌的检测灵敏度可达100ag基因组DNA,比常规扩增方法提高了1万倍。利用设计的GF1／GR2特异性引物与ITS区通用引物进行巢式PCR扩增．可灵敏地扩增出油茶根腐病菌层生镰刀菌DNA。