PCR检测鸭疫里默氏菌的研究

对本研究室分离、鉴定并保存的42株鸭疫里默氏菌(包括8个血清型)、9株鸭源大肠杆菌和4株鸭源禽多杀性巴氏杆菌进行PCR扩增，结果所有的鸭疫里默氏菌均能扩增出809bp的特异性DNA片段，而鸭源大肠杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌均为阴性。试验证明以细菌DNA和全菌体分别作模板，对PCR的扩增结果无影响。经过优化的该PCR方法能检测出的最低DNA量为1pg。     

4株鸭疫里默氏杆菌的PCR快速鉴定及药敏试验

从湖北省武汉郊区和监利市两地的发病雏鸭分离纯化到4株鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA),通过对该菌形态学鉴定、生化试验、细菌16S rRNA的快速鉴别诊断证明了4株细菌均为鸭疫里默氏杆菌.将不同来源的菌株各选一株HBSPX和HBJL,进行了16S rRNA目的片段的扩增并测序,测序结果表明这两株细菌与其他鸭疫里默氏杆菌的16S rRNA同源性高达99.4％和98.9％.药敏试验结果表明,HBSPX株对阿莫西林、先锋Ⅵ高度敏感,但HBJL株对氯洁霉素和红霉素高度敏感.     

鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因生物信息学分析及其原核表达

[目的]了解鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因分子生物学特性,确定其编码蛋白抗原性,为鸭疫里默氏杆菌亚单位疫苗研发提供新的靶标抗原选择.[方法]采用PCR克隆鸭疫里默氏杆菌AS87-01740基因,以DNASTAR和NCBI数据库分别进行基因生物信息学分析;利用pCold-TF原核表达载体在大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达,并分别以SDS-PAGE和Western blotting检测融合蛋白的表达形式及其抗原特异性.[结果]从鸭疫里默氏杆菌基因组扩增获得的AS87-01740基因编码框全长618 bp,编码205个氨基酸,理论分子量约21.87 kD,理论等电点(pI)8.2,正电荷氨基酸总数17个,负电荷氨基酸总数16个.AS87-01740蛋白序列在同种属分离株中,与2型血清型分离株(11845、YM、GD和CH-2)有很高的相似性(>99%),与1型血清型分离株(CH-1和CH-3)的相似性为92%;在不同种属中,与金黄杆菌(Chryseobacterium sp.)、动物溃疡伯格菌(Bergeyella zoohelcum)和脑膜炎败血伊丽莎白菌(Elizabeth-kingia meningosepticum)的相似性分别为61%、60%和57%.经异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得的融合蛋白分子量约77 kD,以可溶性表达形式为主.Western blotting检测结果表明,融合蛋白能与鸭疫里默氏杆菌阳性血清发生特异性免疫反应.[结论]AS87-01740基因编码蛋白在不同鸭疫里默氏杆菌分离株中具有很高的保守性,且能与其阳性血清发生特异性免疫反应,是研发鸭疫里默氏杆菌疫苗的潜在抗原.     

基于鸭疫里默氏杆菌16SrRNA PCR检测方法的建立和应用

根据GenBank中鸭疫里默氏杆菌(RA)16SrRNA基因序列设计特异性引物,建立了基于鸭疫里默氏杆菌16SrRNA PCR检测方法。以建立的PCR方法对RA、大肠杆菌、沙门氏菌、鸭源金黄色葡萄球菌、两双歧杆菌、短乳酸杆菌、屎肠球菌和短小芽孢杆菌进行检测,结果只有RA DNA能扩增出844 bp的特异条带,其他细菌的DNA不能扩增出任何条带;从凝胶中回收DNA条带,测序结果与GenBank中RA相应序列完全一致。对不同稀释度的RADNA样品进行扩增,PCR对RA DNA最小检出量为22 pg,最少检出RA 80 CFU/mL。以该PCR方法对可疑为RA的临床病料和菌株进行检测和鉴定,结果与细菌分离鉴定吻合率为100%。表明本研究所建立的基于RA 16SrRNAPCR方法具有快速、灵敏、特异的优点,可用于RA感染的检测、分子流行病学调查和分离菌株的快速鉴定。     

鸭疫里默氏杆菌PCR快速检测方法的建立

鸭疫里默氏杆菌病对养鸭业危害严重,传统及常规检测方法均有不足,因此有必要建立起一种更加快速简捷、敏感实用的菌落PCR法。根据GenBank公布的鸭疫里默氏杆菌ATCC株OMPA基因序列,在基因保守区设计特异性引物,直接挑取单菌落作为模板,从分离鉴定的1,2,10,11型15株菌及1,2,10,11型4株参考菌株中均能扩增出大小为670 bp的特异性核酸片段,而对照的大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性;将培养菌用TE作10倍梯度稀释,最低检出限量为80个鸭疫里默氏杆菌;建立的菌落PCR与常规PCR法比较,两种方法均能扩增出相同的特异性条带。结果表明,菌落PCR法具有较好的特异性和敏感性,与常规PCR法结果完全一致,且更加快速简捷,在临床应用上具有更好的实用价值。     

商品鸭H9亚型禽流感病毒与鸭疫里默氏杆菌混合感染的诊断

[目的]对某肉鸭场病死鸭进行病原学诊断。[方法]通过细菌分离培养等常规细菌学鉴定方法,并结合PCR、RT-PCR等分子生物学手段对病死鸭的病原体进行分离与鉴定,并对分离到的细菌进行药敏试验。[结果]该批病死鸭的发病原因确定为H9亚型禽流感病毒与鸭疫里默氏杆菌混合感染。药敏试验结果表明,分离的鸭疫里默氏杆菌只对多西环素、头孢他啶以及环丙沙星、诺氟沙星等喹诺酮类药物敏感。[结论]该药敏试验结果可为临床预防和治疗鸭疫里默氏杆菌感染的用药选择提供一定的参考依据。     

鸭疫里默菌河南株的分离与鉴定

为了研究鸭疫里默菌的生物学特性及其发病机制,从河南地区某鸭场临床症状、剖检病变疑似鸭疫里默菌病例进行细菌分离,从中分离到1株细菌。对分离的病菌进行形态培养、生化试验、动物试验、琼扩试验和血清型鉴定,鉴定为鸭疫里默菌3型。药敏实验表明鸭疫里默菌对头孢噻肟、卡那霉素、环丙沙星等敏感性较高。     

PCR法快速检测鸭疫里氏杆菌的研究

根据Gen-Bank中25株鸭疫里氏杆菌(RA)的外膜蛋白A(OmpA)基因序列,在其高度保守区设计了一对特异性引物,成功地建立了鸭疫里氏杆菌的快速、准确PCR检测方法。RA参考菌株J04(2型)、J07(JX1型)均能扩增出67lbp的特异性目的条带,而对鸭源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭源沙门氏菌、鸭源葡萄球菌的扩增结果均为阴性。PCR产物经EcoRI酶切鉴定得494bp和177bp两个预期条带。最低检出基因组DNA浓度为800fg。用全菌体进行PCR时,本实验室分离鉴定的60株RA均能够扩增出特异性目的条带。25份临床疑似病例的分离菌株的PCR扩增阳性率与生化鉴定率完全一致。该方法表明能从痫料组织培养8h的混合菌群中快速、准确地检测到RA,可用于RA的快速诊断和流行病学调查。     

14株鸭疫里默氏杆菌的部分生物学特性分析

为了解鸭疫里默氏杆菌的流行情况,对信阳地区疑似鸭疫里默氏杆菌感染病料进行病原分离和鉴定。结果显示,共鉴定到14株鸭疫里默氏杆菌,其中血清1型、2型和10型菌株依次为3、4、2株,未定血清型菌株5株;动物致病性试验结果显示,分离菌对雏鸭均具有致病性。对11种抗菌药物敏感性检测结果表明,分离菌株对阿米卡星、链霉素和头孢曲松较为敏感,对氟苯尼考、阿莫西林、磺胺异■唑、多黏菌素B和多西环素耐药性较高;生物被膜检测结果表明,14株菌株中有8株为强生物被膜形成株,2株为弱生物被膜形成株。     

鸭疫里默氏杆菌的分离、鉴定及培养条件优化

从江苏某养鸭场的病死鸭中分离到2株细菌,通过菌落观察、染色镜检、生理生化和分子生物学方法鉴定为2株1型鸭疫里默氏杆菌（RA）。通过对其培养条件的研究表明,鸭疫里默氏杆菌在振荡培养、培养基中加2%初生牛血清的条件下长势最好,且振荡比增加培养基营养更能促进RA的生长。动物回归试验表明,鸭疫里默氏杆菌对雏鸭有较强的致病力,但可能因为单一病原侵染的原因,动物回归试验雏鸭病死率相对较低。     

两株PGPR对豇豆苗期生长及土著细菌群落的影响

以扬豇40为材料,研究了植物根际促生菌Pseudomonas chlororaphis RA6和Bacillus pumilus WP8对豇豆种子出苗及幼苗生长的作用,评价浸种及拌土处理的差异,揭示一段时间内,两株植物根际促生菌(PGPR)在土壤中的行为特征及其对土著细菌群落结构的影响。结果表明:PGPR对豇豆的促生作用因接种方式、接种量的不同而不同。WP8、RA6浸种处理的出苗率分别比对照提高14.29%和9.52%(P<0.05);15 d时的株高分别比对照提高14.39%和10.40%(P<0.05);茎叶干物重分别比对照增加19.69%和17.71%(P<0.05)。WP8、RA6低剂量拌土处理(104cfu·g-1soil,以下简作"低拌处理")各指标与对照相比,均无显著差异(P>0.05)。WP8、RA6中剂量拌土处理(106cfu·g-1soil,以下简作"中拌处理")出苗率和株高均比对照提高,但未达显著差异(P>0.05);茎叶干物重分别比对照增加12.71%和18.59%(P<0.05)。WP8、RA6高剂量拌土处理(108cfu·g-1soil,以下简作"高拌处理")出苗率分别比对照提高9.52%和14.29%(P<0.05);15 d时的株高分别比对照提高6.37%和7.64%(P<0.05);茎叶干物重分别比对照增加27.37%和20.43%(P<0.05)。DGGE指纹图谱分析结果显示:各处理在15 d和45 d时,除WP8浸种处理外,其余土壤微生物群落多样性和对照均已发生明显变化,随时间推延,RA6菌株在土壤中优势地位更趋明显,表现在45 d时仍可明显检测到;WP8在土壤中存活时间不长,但拌土处理改变了土著细菌的群落结构。推测WP8的促生作用很可能与土著微生物群落的变化有关。     

1型和2型鸭疫里默氏菌的交叉保护

通过PCR扩增、克隆、序列测定获得29株鸭疫里默氏菌(RA)的16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区的核苷酸序列.将16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区序列连接后分析发现,1型菌株和大多数2型菌株分别处于不同的分支,而2型菌株中的RAf11、RAf3和RAf104不处在2型菌株的分支中,却与1型菌株非常接近.挑选RAf11菌株和2型分支中的RAf19菌株,分别制备灭活苗,免疫雏鸭后进行攻菌保护试验,RAf11菌株对1型菌株的攻击可产生较高的交叉保护率,达53.8%,而RAf19菌株对1型菌株攻击的保护率仅为23.1%.借助16S rRNA和16S-23S rRNA间隔区序列的分析,筛选到一株具交叉保护的RA菌株.     

鸭疫里默氏杆菌中国分离株的外膜蛋白A基因的克隆与序列分析

为了对鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)中国分离株的外膜蛋白A(OmpA)基因的序列进行分析,根据GenBank中已发表的鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer,RA)的外膜蛋白A(Om-pA)基因序列,在其高度保守区设计一对特异性引物,应用PCR技术,分别扩增从中国广东、福建和山东等地分离的8株鸭疫里默氏杆菌中国分离株的OmpA基因,克隆测序后与GenBank中已发表的26株鸭疫里默氏杆菌进行序列比较,结果表明:所有菌株的OmpA基因均为由1164个碱基组成的ORF,编码387个氨基酸组成的蛋白质,起始密码子均为ATG,终止密码子均为TAA,其核苷酸序列非常保守,同源性高达88.2%~100%,氨基酸同源性达到88.9%~100%。试验表明,OmpA基因具有种内相对保守性,其核苷酸与氨基酸同源性与鸭疫里默氏杆菌的血清型、分离时间和地点之间无必然联系。     

鸭疫里默氏菌2型分离鉴定及药敏试验

鸭传染性浆膜炎是由鸭疫里默氏菌引起的危害雏鸭的一种急性或慢性败血性传染病。其中以鸭疫里默氏菌2型对我国养鸭场造成的危害最大。本试验通过从山东、广西、四川等地分离的20株2型鸭疫里默氏菌分离株的生理生化、药敏试验发现:这20株2型菌分离株其生理生化特性一致;分离株表现不同程度的耐药性,对头孢噻肟钠、氟苯尼考、绿都肠乐、罗红霉素、阿奇霉素和阿莫西林敏感度较高。将20株分离菌株培养物分别接种15日龄健康雏鸭,每只颈部皮下注射1.0×106CFU/ml,观察10天。结果表明:20株分离株对15日龄雏鸭致病性差异较大,致死率从0到100%不等,其中sd-5株致病性最强,致死率为100%;其次分别为sd-4(致死率80%)和hy-2(致死率70%)。     

朱砂叶螨对阿维菌素及高温的交互耐性

以朱砂叶螨敏感种群(SS)、抗阿维菌素种群(RA)和耐高温种群(RH)为材料,应用生物测定方法以及荧光实时定量PCR技术,研究朱砂叶螨抗药性和耐高温间存在的交互耐性及机制.结果显示:46℃高温下RH和RA种群的半致死时间(LT50)显著长于SS种群,其顺序依次是:RHRASS,阿维菌素对朱砂叶螨的半致死浓度(LC50)各种群间的顺序依次是:RARHSS,其中,RH和RA种群显著高于SS种群.这表明长期的高温胁迫能诱导其对阿维菌素药剂的抗性,同样对阿维菌素的抗药性也能诱导其对高温的耐性.SS、RA和RH经阿维菌素处理后体内O2?(超氧自由基)含量分别是对照的2.08、1.85和2.00倍,SOD(超氧化物歧化酶)活性分别是对照的3.81、4.84和4.26倍,CAT(过氧化氢酶)和POD(过氧化物酶)活性也都高于对照;经高温(40℃)和低温(4℃)处理后,O2?及SOD、CAT和POD活性也表现出相同的趋势.说明朱砂叶螨虫体内的O2?、SOD、CAT和POD与阿维菌素药物和热(冷)刺激有关,RA和RH在长期阿维菌素或高温胁迫作用下对保护酶活性的诱导能力加强.朱砂叶螨Tc HSP90 mRNA在正常情况下的表达是RA和RH高于SS,分别是SS的1.64倍和1.29倍,经阿维菌素、高温(40℃)和低温(4℃)处理后,RA和RH的表达量显著高于SS,表明朱砂叶螨HSP90在抗药性和耐热性方面发挥了作用.     

江西地区鸭疫里氏杆菌微生物学特性的研究

从江西省鸭鹅中分离到 6 0株鸭疫里氏杆菌 ,采用凝集试验和琼脂扩散试验对其血清型进行了鉴定 ,结果表明江西存在 5个血清型的鸭疫里氏杆菌 (2、JX1、JX2、JX3、JX4型 ) ,2、JX1、JX2型为目前江西地区主要流行的血清型。 80 %以上分离株对青霉素、痢特灵、氨苄青霉毒和氯霉素高度敏感 ,对阿米卡星、庆大霉素和链霉素耐药。不同血清型鸭疫里氏杆菌的培养特性较为一致 ,但部分生化特性存在较大差异     

3种酵母对蛇龙珠干红葡萄酒发酵过程中主要理化指标的影响

试验选用3种酵母菌株BM45、RA17和VintageRed进行蛇龙珠干红葡萄酒发酵,分析蛇龙珠干红葡萄酒酿造过程中主要理化指标的动态变化.结果显示:不同酵母菌株发酵条件下,葡萄酒中总酸含量变化趋势基本相同;发酵结束后,经BM45发酵的葡萄酒中酒精度达12.3%,干浸出物为25.38g/L,明显高于采用RA17和Vin-tage Red酿制的葡萄酒;与其它2种酵母菌株相比,采用BM45发酵的蛇龙珠干红葡萄酒具有更好的品质.     

鸭疫里氏杆菌赘生物提取及其理化特性研究

为了提取纯净的鸭疫里氏杆菌赘生物,比较了4种培养基培养RAⅡ型菌和4种提取赘生物试验的方法,结果表明,马丁琼脂培养的RA菌赘生物含量较高,杂质少,适宜于作为提取赘生物用的培养基;差速离心结合滤膜过滤法能有效地把细菌和赘生物分离开来,提取到较纯的赘生物.赘生物的核酸检测和蛋白质电泳分析表明,赘生物无核酸存在,蛋白质电泳图谱与菌体相似形态学观察表明,提取的赘生物可分为大、中、小三类,大的和中等的赘生物外层为一层厚的壁,中央为三角形或四边形样的核物质;小的赘生物为圆形,有一层很薄的外膜,中央为点状或星状的核.研究结果为该菌的分类提供了一定的科学依据.