鸡Igγ轻链绿色荧光蛋白融合分子在COS7细胞膜的表达

将牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区序列嵌合入鸡Igγ轻链基因中，并将鸡Igγ轻链信号肽与Pegfp—C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体Pegfp—C1-SP。鸡Igγ轻链基因嵌合分子定向克隆入载体的多克隆位点，构建了带有信号肽的鸡Igγ轻链／GFP融合蛋白真核表达载体。转染COS7细胞后，荧光显微镜观察，重组鸡Igγ轻链／GFP蛋白在COS7细胞膜及膜周围有明显表达，而载体pEGFP—C1转染的COS7细胞GFP则分布在细胞及细胞核。结果表明，牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区能介导融合蛋白在细胞膜上的表达。     

鸡Igλ轻链绿色荧光蛋白融合分子在COS7细胞膜的表达

将牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区序列嵌合入鸡Igλ轻链基因中,并将鸡Igλ轻链信号肽与Pegfp-C1载体的绿色荧光蛋白N端融合产生带有信号肽的中间载体Pegfp-C1-SP。鸡Igλ轻链基因嵌合分子定向克隆入载体的多克隆位点,构建了带有信号肽的鸡Igλ轻链/GFP融合蛋白真核表达载体。转染COS7细胞后,荧光显微镜观察,重组鸡Igλ轻链/GFP蛋白在COS7细胞膜及膜周围有明显表达,而载体pEGFP-C1转染的COS7细胞GFP则分布在细胞及细胞核。结果表明,牛IgG Fc受体γRⅡ的跨膜区能介导融合蛋白在细胞膜上的表达。     

牛IgG Fc受体Ⅱ胞外区在大肠杆菌中的表达及特性鉴定

从牛肺巨噬细胞cDNA文库中扩增编码牛IgGFc受体Ⅱ(boFcγRⅡ)胞外区基因,PCR产物经EcoRⅠ和HindⅢ双酶切后,插入原核表达载体pET28a的T7启动子下游,构建重组表达质粒pETboRⅡ。以pETboRⅡ转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析诱导表达菌体可见分子量约为27kDa的蛋白条带,该表达蛋白在细胞质中主要以不溶性包涵体形式存在。Westernblotting和Dotblot检测表明,boFcγRⅡ重组蛋白在变性条件下可与牛IgG特异结合,提示牛FcγRⅡ胞外区可能存在IgG线性结合表位。     

猪IgGⅡB类Fc受体剪接异构体胞外区及结构域的原核表达与抗体制备

根据GenBank中猪IgGⅡB类Fc受体剪切异构体基因序列(FJ608551),利用Primer 5.0软件设计合成3对特异性引物,从质粒pTG 19 -T-swFcγRIIB1中用PCR方法扩增编码胞外区、EC1及EC2结构域蛋白分子基因片段,PCR产物经KpnⅠ和EcoR Ⅰ双酶切后将其插入到原核表达载体pET-...     

人IL-32-IgG4（Fc）融合蛋白在CHO/DG44细胞中的表达

【目的】构建人白细胞介素32(IL-32)和IgG4 Fc段的融合基因真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOp-tiVEC,建立稳定转染的中华仓鼠卵巢细胞(CHO/DG44)克隆,并检测其重组蛋白的表达。【方法】用PCR方法从脂多糖(LPS)激活的人CD4+T细胞cDNA中扩增出IL-32蛋白基因,并克隆到IgG4(Fc)-pOptiVEC载体上,构建重组质粒IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,并进行酶切和测序鉴定。采用脂质体法,将重组质粒线性化后转染CHO/DG44细胞,进行RT-PCR检测,筛选阳性克隆,并对筛选的阳性克隆进行氨甲喋呤(MTX)加压筛选。利用ProteinG-Agarose亲和层析纯化转染CHO/DG44细胞培养上清液中的融合蛋白IL-32-IgG4(Fc),通过SDS-PAGE、Western-blot对融合蛋白IL-32-IgG4(Fc)的表达和生物学活性进行检测。【结果】PCR扩增获得了长度为564 bp的人IL-32蛋白基因cDNA,经测序与GenBank报道的序列一致。真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,获得了IL-32蛋白基因片段,其长度为564 bp。筛选出了能稳定表达IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。亲和纯化后的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白经SDS-PAGE和Western-blot鉴定,其分子质量约为50.0 ku,与预期结果一致。MTX加压后,IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的表达量明显升高。【结论】成功构建了人IL-32蛋白融合基因的真核表达载体IL-32-IgG4(Fc)-pOptiVEC,获得了能够表达具有生物学活性的IL-32-IgG4(Fc)融合蛋白的CHO/DG44细胞克隆。     

牛IgG2 Fc受体的真核表达、纯化与结晶

【目的】制备牛IgG2 Fc受体(boFcγ2R)蛋白并分析其结构与生物学功能,为进一步研究其免疫学功能奠定基础。【方法】PCR扩增boFcγ2R的胞外区基因片段,将其克隆至真核表达载体pMT/BiP/V5-His A构建重组pMT/BiP-boFcγ2R-His质粒,利用果蝇胚胎Drosophila Schneider 2(S2)细胞表达boFcγ2R胞外区重组蛋白,通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析对目的蛋白进行纯化,利用Dot-blot验证其生物学功能;采用蒸汽扩散坐滴法对目的蛋白进行结晶,对晶体进行X-ray衍射分析;利用去糖基化酶Endo Hf和PNGase F对目的蛋白进行处理,以验证其糖基化修饰与晶体无衍射之间是否存在因果关系。【结果】PCR扩增获得了663 bp的boFcγ2R基因胞外区片段。成功构建了pMT/BiP-boFcγ2R-His载体,将其转染S2细胞后诱导表达出26 ku的boFcγ2R胞外区重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,通过镍柱亲和层析、凝胶过滤层析的纯化方法得到了高纯度的boFcγ2R胞外区重组蛋白;Dot-blot结果显示,该蛋白具有较好的生物学功能。蛋白结晶的2个条件是:体积分数15%Tacsimate~(TM)(pH 7.0)、0.1 mol/L HEPES (pH 7.0)、20 g/L PEG 3350和0.1 mol/L HEPES (pH 7.5)、250 g/L PEG 3350。蛋白初筛晶体无衍射,去糖基化试验验证了boFcγ2R胞外区蛋白初筛晶体无衍射可能与其糖基化有关的推测。【结论】得到了高纯度的boFcγ2R胞外区重组蛋白,获得其初筛晶体。     

谷胱甘肽-S-转移酶-ASPP2融合蛋白的原核表达及纯化

为表达并初步纯化包含ASPP2活性区域和不包含其活性区域的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)-ASPP2融合蛋白。采用PCR扩增两段ASPP2基因短片段,在引物5'端和3'端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,将其克隆进入原核表达载体pGEX-4T-1;异丙基硫代-半乳糖苷(IPTG)诱导重组质粒pGEX-4T-1-ASPP2在大肠杆菌BL21(DE3)中表达同时带有谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签的融合蛋白;超声法裂解大肠杆菌,应用谷胱苷肽琼脂糖树脂纯化可溶的GST-ASPP2融合蛋白;通过SDS-PAGE和Western blot验证GST-ASPP2融合蛋白的表达。结果表明,已成功的构建了GST-ASPP2小片段融合蛋白表达载体,在Western blot分析中,4个蛋白条带均能被鼠抗GST单克隆抗体特异性识别,条带所在位置和GST-ASPP2的分子质量相符。构建了GST-ASPP2重组质粒,在大肠杆菌BL21中高效表达GST-ASPP2融合蛋白,为进一步研究ASPP2全长,N-末端和C-末端生理意义奠定了基础。     

鸡Igλ轻链基因克隆、序列分析及其在COS7细胞膜上的定位表达

为了研究鸡B细胞膜免疫球蛋白(mIg)的功能,深入了解鸡免疫系统抗体基因的特点,从鸡法氏囊B细胞cDNA中扩增出Igλ轻链基因,对其核苷酸序列和氨基酸序列进行了分析和比较。该基因cDNA全长873bp,编码含226个氨基酸的Igλ轻链,N-端21个氨基酸构成轻链信号肽,随后是2个Ig样结构域。运用融合PCR的方法将该基因与牛IgG Fc受体γRⅡ跨膜区序列嵌合形成重组跨膜分子,构建真核表达载体pcDNA-λR2T,转染COS7细胞,荧光抗体染色及流式细胞术检测到重组鸡Igλ轻链在细胞膜上的表达。所扩增的鸡Igλ轻链基因以及构建表达于细胞膜上的重组鸡Igλ轻链跨膜分子,为研究鸡免疫系统中的抗体轻链基因,探索Igλ轻链和B细胞膜免疫球蛋白的功能奠定技术基础。     

牛eIF5基因原核表达与蛋白纯化

研究应用PCR方法扩增牛e IF5基因编码序列,通过Eco RⅠ和SalⅠ酶切位点将其定向插入p GEX-4T-1载体,构建原核表达重组质粒p GEX-4T-1-e IF5,并转化大肠埃希菌BL21。酶切和测序鉴定正确后,用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)大量诱导表达,利用GST-Sepharose 4B亲和珠纯化,SDS-PAGE和Western Blot鉴定。结果表明,原核表达载体p GEX-4T-1-e IF5构建成功,Western Blot证实融合蛋白大量表达,纯化后获得GSTe IF5融合蛋白,为深入研究牛e IF5蛋白功能奠定基础。     

PCR克隆高GC含量牛Fcγ2R cDNA

根据已发表的牛Fcγ2RcDNA序列设计1对引物,采用改进的RT -PCR技术从牛外周血淋巴细胞总RNA中扩增出了GC含量为6 4%的牛Fcγ2RcDNA分子,克隆片段全长795个核苷酸,含有一个完整的开放阅读框,编码2 6 5个氨基酸,和已报道的序列相比存在3个碱基突变。改进的PCR技术也可用于其他高GC含量基因的快速扩增     

表达可溶性猪唾液酸黏附素重组腺病毒的构建和鉴定

猪唾液酸黏附素(pSn)是猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染宿主的重要受体。采用RT-PCR和基因合成方法构建能够表达猪Sn蛋白前4个Ig样结构域(Sn4D)和IgG1Fc片段融合蛋白的穿梭载体pShuttle-Sn4D-Fc,利用AdEasyTMAdenoviral Vector System制备重组腺病毒。透射电子显微镜观察表明,构建重组病毒rAd-Fc和rAd-Sn4DFc具有典型腺病毒形态;在重组腺病毒感染的细胞中,RT-PCR能检测到预期的Fc和Sn4D-Fc转录子;在重组腺病毒转导细胞裂解物及培养上清中,Western-blot能检测到预期的28ku Fc或72ku Sn4D-Fc蛋白;从重组病毒转导细胞培养上清中纯化的Fc和Sn4D-Fc蛋白为单一的条带,能被抗猪IgG或Sn抗体识别。结果表明:成功构建了分泌表达猪Fc片段和Sn4D-Fc融合蛋白的重组腺病毒,为用Sn可溶性受体阻断抗PRRSV感染研究打下基础。     

流产布鲁氏菌BCSP31基因在大肠杆菌中的可溶性高效表达

设计1对引物,突变除去布鲁氏菌BCSP31(细胞表面蛋白31)基因的N端信号肽氨基酸序列,经NotⅠ和EcoRⅠ酶切后与相同处理的表达载体pGEX-4T-1连接,转化BL21(DE3)感受态细胞。酶切及PCR扩增鉴定,获得阳性克隆,测序证明其阅读框完全正确。用IPTG诱导表达构建成功的阳性克隆,对产物进行SDS-PAGE和Western-blotting检测,发现表达产物出现预期分子量57 kD的融合蛋白,该蛋白能与牛流产布鲁氏菌阳性血清发生反应,进一步证明目的蛋白主要以可溶性形式存在,表达量约占总蛋白的40%,应用GST琼脂糖凝胶FF纯化可得到纯度较高的表达产物。     

新疆牛环形泰勒虫TamsⅠ基因原核表达条件的优化及蛋白纯化

为了提高新疆牛环形泰勒虫TamsⅠ基因在大肠杆菌中的表达量,研究了温度、诱导时间以及诱导剂（IPTG）浓度等不同条件对TamsⅠ融合蛋白表达量的影响。试验结果表明,大肠杆菌菌株BL21（DE3）在37℃培养2．5h后,使用终浓度为2mmol／L的IPTG在25℃振荡诱导培养8h时,GST—TamsⅠ融合蛋白表达量最高,达到2．5rmg／mL。用GST-Sepharose 4B亲和层析柱对GST—TamsⅠ融合蛋白进行纯化,SDS-PAGE检测表明GST-TamsⅠ融合蛋白大小约为56kl）,与预计的分子量大小一致。TamsⅠ基因的优化表达为牛环形泰勒虫病的分子免疫学诊断和哑单位疫苗的研制奠定了基础。     

牛金属硫蛋白素bMTcin编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达研究

以本实验室由RT-PCR扩增得到的含有牛金属硫蛋白（bMT）cDNA的重组质粒pYJ101为模板，PCR扩增出牛金属硫蛋白素bMTcin的编码区，将其克隆到pGEM-T载体上并进行DNA序列测定。利用融合表达载体pGEX4T-1，在E.coli中诱导表达bMTcin，经过Glutathine Sepharose 4B亲和层析纯化后，SDS-PAGE检测GST:bMTcin的条带。结果表明，所克隆的bMTcin序列全长为141bp，其DNA序列与原模板中的序列完全相同，与GenBank中另外5个bMTcinDNA相比，第31位和86位与Conneely的序列为A和G，导致第11位（Thr）第29位（Arg）的氨基酸不同于其他4个序列（11位为Ala，29位为Lys）。融合表达蛋白GST:bMTcin的表达量大约为1.1mg/L发酵液。     

口蹄疫病毒VP1蛋白可溶性表达标签筛选

为了提高口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,根据A型口蹄疫病毒核酸序列设计并合成了口蹄疫病毒VP1片段,将其克隆到p ET21b(+)载体上,设计1对通用引物扩增10个融合标签Grifin、GST、Nus A、SUMO、Thioredoxin、Protein G、γ-crystallin、Ars C、Ppi B、MBP,并分别将扩增的融合标签与VP1连接构建重组质粒,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),0.5 mmol/L IPTG诱导其表达。SDS-PAGE结果表明,MBP、Grifin和GST能够促进口蹄疫病毒VP1蛋白的可溶性表达,其中MBP与VP1融合表达蛋白可溶部分占60%;Western blot鉴定分析结果显示,小鼠抗His标签单克隆抗体能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了具有免疫学活性的融合蛋白MBP-VP1。     

家畜IgG Fc受体研究进展

IgG Fc受体(Fcγreceptors,FcγRs)是一类重要的免疫细胞表面分子,对细胞反应的正向和负向调节发挥重要的免疫学功能,是治疗过敏和自身免疫性疾病理想的药物靶标。综述了FcγRs亚类的生物学特性及家畜FcγRs的研究进展,并对FcR(Fc受体)免疫学功能也进行了阐述。     

普通烟草铁氧还蛋白Ⅰ的原核表达、抗体制备及在ToMV侵染烟草体内表达分析

【目的】构建普通烟草铁氧还蛋白I(ferredoxin I,Fdn-Ⅰ)原核表达载体,表达可溶性Fdn-Ⅰ蛋白,并制备其多克隆抗体,分析Fdn-Ⅰ在ToMV侵染烟草叶片内的表达情况。【方法】以Fdn-Ⅰ全长cDNA为模板,用PCR扩增Fdn-Ⅰ,克隆至原核表达载体pEGX-6p-1,构建Fdn-Ⅰ与GST融合表达载体pEGX-Fdn-Ⅰ,重组质粒转化原核表达菌株BL21,优化GST-Fdn-Ⅰ可溶性表达条件后大量表达蛋白,用GST亲和层析法纯化获得可溶性GST-Fdn-Ⅰ蛋白,免疫家兔制备多克隆抗体。ELISA测定抗体效价,Western印迹法检测抗体的特异性和ToMV侵染前后烟草叶片内Fdn-Ⅰ的表达情况。【结果】在温度为28℃,IPTG诱导浓度为0.3mmol·L-1条件下表达出大小为41.3kD的可溶性融合蛋白。纯化获得约4mg可溶性蛋白,免疫家兔制备了效价为1/6400的多克隆抗体。Western印迹结果表明,该抗体可以与Fdn-Ⅰ的原核和酵母表达产物特异性结合。分析表明Fdn-Ⅰ在ToMV侵染后烟草叶片内含量明显低于其在健康烟草叶片内的含量。【结论】通过Fdn-Ⅰ大肠杆菌中的可溶性表达,制备获得了其高效价特异性多克隆抗体,利用该抗体检测表明ToMV侵染烟草降低了Fdn-Ⅰ的表达。     

埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基融合蛋白的真核表达与纯化

埃博拉病毒糖蛋白与病毒黏附、入侵宿主细胞等过程密切相关,为了更好地研究该糖蛋白与宿主细胞的相互作用,拟通过哺乳动物细胞表达系统,构建GP1亚基Fc标签融合蛋白。经鉴定,成功构建了埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基的真核表达载体pFUSE-GP1-hIgG1-Fc2,并利用该载体及293T细胞构建了表达GP1亚基融合蛋白的哺乳动物细胞系。该融合蛋白N端带有IL2分泌信号肽,C端带有人IgG1-Fc2标签,可在293T细胞以分泌表达的方式存在于细胞培养上清中,而后利用Protein A亲和层析进行融合蛋白纯化。经Western Blots鉴定,成功制备GP1-Fc融合蛋白。这不仅为埃博拉病毒糖蛋白的研究提供了技术支撑,也为其他种类蛋白的哺乳动物细胞真核表达纯化提供了新思路。     

埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基融合蛋白的真核表达与纯化

埃博拉病毒糖蛋白与病毒黏附、入侵宿主细胞等过程密切相关,为了更好地研究该糖蛋白与宿主细胞的相互作用,拟通过哺乳动物细胞表达系统,构建GP1亚基Fc标签融合蛋白。经鉴定,成功构建了埃博拉病毒糖蛋白GP1亚基的真核表达载体pFUSE-GP1-hIgG1-Fc2,并利用该载体及293T细胞构建了表达GP1亚基融合蛋白的哺乳动物细胞系。该融合蛋白N端带有IL2分泌信号肽,C端带有人IgG1-Fc2标签,可在293T细胞以分泌表达的方式存在于细胞培养上清中,而后利用Protein A亲和层析进行融合蛋白纯化。经Western Blots鉴定,成功制备GP1-Fc融合蛋白。本研究不仅为埃博拉病毒糖蛋白的研究提供了技术支撑,也为其它种类蛋白的哺乳动物细胞真核表达纯化提供了新思路。     

核蛋白Sam68的原核表达及鉴定

为了构建pGEX-4T-1-Sam68原核表达载体,表达并鉴定GST-Sam68融合蛋白,采用PCR扩增Sam68基因,插入pGEX-4T-1的Eco R I和Sal I位点,并转化Rosetta(DE3)大肠杆菌,IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot验证蛋白表达,GST pull-down技术验证Sam68的结合活性。酶切和测序结果证实Sam68基因正确插入pGEX-4T-1载体中,载体能够在Rosetta(DE3)细胞中正确表达,且纯化的GST-Sam68蛋白具有与PI3K p85特异结合的活性,说明成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-Sam68。