猪小肠黏膜上皮细胞原代培养

分别采用酶消化法和组织块培养法,建立了猪小肠黏膜上皮细胞原代培养的方法。酶消化法于37℃分为4个处理组进行。处理1以2.5 g/L的胰蛋白酶消化30 min;处理2以2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min;处理3以50 mg/L嗜热菌蛋白酶消化50 min;处理4以50 mg/L嗜热菌蛋白酶+2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min。采用柠檬酸胰酶法分离纯化细胞。结果表明,组织块法原代培养获得的细胞活性较强。     

鸡胚盲肠上皮细胞原代培养与鉴定

为研究鸡E.tenella的宿主细胞--盲肠上皮细胞体外培养技术,为E.tenella损伤机制及抗球虫药的研究提供体外模型,分别用胰蛋白酶法、胶原酶Ⅰ法、嗜热菌蛋白酶法、嗜热菌蛋白酶+胶原酶Ⅰ法和中性蛋白酶Ⅰ+胶原酶Ⅺ法分离纯化原代鸡胚盲肠上皮细胞,通过测定细胞活力、细胞团块比例、总细胞产量和细胞团块产量,筛选出鸡胚盲肠上皮细胞最佳分离方法,并进行了纯化和培养,对培养细胞进行了鉴定.结果表明:嗜热菌蛋白酶消化、低速离心去除单细胞、差速贴壁除去成纤维细胞,为最佳分离和纯化盲肠上皮细胞的方法;分离纯化的细胞接种后分别于第3-5天、第10-11天进入对数生长期,可存活14 d以上;经形态学观察、碱性磷酸酶染色、扫描电镜鉴定为盲肠上皮细胞,所分离的细胞培养至第4、7、11天时上皮细胞比例分别为81.67%、84.33%和72.00%.用该法可获得纯度较高的原代鸡胚盲肠上皮细胞.     

几种酶分离山羊小肠上皮细胞方法的比较

用不同酶消化分离山羊小肠上皮细胞,从而找到最佳的分离方法,为进一步研究IEC提供合适的细胞模型。本研究分别用胶原酶Ⅰ、嗜热菌蛋白酶、胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ消化分离刚出生未进奶的山羊小肠上皮细胞,通过观察IEC生长状态、形态特征、抗原鉴定比较哪种分离效果最佳。结果表明,联合用胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ1h可分离出大量健全绒毛隐窝单位,进一步培养获得的小肠粘膜上皮(IEC),上皮细胞膜抗原均呈阳性,用胶原酶Ⅰ和嗜热菌蛋白酶分离得到的大部分是成纤维细胞。选用用胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ作为分离IEC的消化酶,可获得较纯的IEC。     

几种酶分离山羊小肠上皮细胞方法的比较

用不同酶消化分离山羊小肠上皮细胞,从而找到最佳的分离方法,为进一步研究IEC提供合适的细胞模型.本研究分别用胶原酶Ⅰ、嗜热菌蛋白酶、胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ消化分离刚出生未进奶的山羊小肠上皮细胞,通过观察IEC生长状态、形态特征、抗原鉴定比较哪种分离效果最佳.结果表明,联合用胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ 1h可分离出大量健全绒毛隐窝单位,进一步培养获得的小肠粘膜上皮(IEC),上皮细胞膜抗原均呈阳性,用胶原酶Ⅰ和嗜热菌蛋白酶分离得到的大部分是成纤维细胞.选用用胶原酶Ⅺ/中性蛋白酶Ⅰ作为分离IEC的消化酶,可获得较纯的IEC.     

组织块再移法分离培养奶山羊乳腺上皮细胞

通过比较组织块贴壁培养法、组织块再移法、胰蛋白酶消化法、胶原酶Ⅱ消化法和胶原酶消化配合组织块贴壁法分离、培养、纯化山羊乳腺上皮细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间,研究乳腺上皮细胞培养效果。结果显示,利用胶原酶消化配合组织块贴壁法不能获得正常生长的乳腺上皮细胞;利用组织块贴壁培养法、组织块再移法和胶原酶Ⅱ消化法获得大量的乳腺上皮细胞,所得到的上皮细胞生长曲线呈典型的＂S＂型,符合细胞生长的一般规律。组织块再移法不仅可快速获得大量纯化的乳腺上皮细胞,而且所得到的细胞经传代后,细胞群体倍增时间最短、增殖能力最强,表明,该法是获得山羊乳腺上皮细胞最适宜的方法。     

小鼠输卵管上皮细胞的原代培养及纯化方法研究

建立小鼠输卵管上皮细胞原代培养及纯化方法.小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用组织块培养法和酶消化法.酶消化法于37℃分为4个处理组进行.处理1以2.5 g/L胰酶+0.4 g/L EDTA消化5、10、20 min;处理2以0.5 g/L胰酶+0.08 g/L EDTA消化35、50、75 min;处理3以0.3 g/L的Ⅰ型胶原酶消化60、90、240 min;处理4以2.5 g/L胰酶+0.4 g/L EDTA和0.3 g/L Ⅰ型胶原酶(1∶2)消化60 min,150 min.原代细胞纯化采用差速贴壁和反复差速贴壁法.传代采用胰酶两步消化法进一步纯化输卵管上皮细胞.组织块法原代培养成纤维细胞生长优势明显,传代纯化细胞效果不佳.用酶消化法原代培养时,处理1效果不理想;处理2采用3个消化时间时均取得比较理想的结果;处理3消化240 min时结果较好;处理4消化150 min效果较好.原代细胞纯化,反复差速贴壁得到的上皮细胞较纯,进一步传代纯化细胞取得了理想的结果.小鼠输卵管上皮细胞原代培养采用酶消化法结合反复差速贴壁分离纯化细胞,传代采用两步消化法,可以成功地进行小鼠输卵管上皮细胞的分离纯化培养.     

华南虎皮肤成纤维细胞的分离培养

应用酶消化法（胶原酶消化：0.1%胶原酶Ⅰ型＋0.1%BSA;胰蛋白酶消化：0.25%胰蛋白酶＋1mM EDTA）和植块法从华南虎皮肤组织中分离成纤维细胞。研究结果表明,植块法较适合分离华南虎皮肤成纤维细胞,胶原酶消化法次之,而胰蛋白酶消化法不宜用于分离华南虎皮肤成纤维细胞。DMEM/F12（1：1）培养基＋10%FCS＋10 ng/ml EGF＋5μg/ml胰岛素＋100 IU/ml青霉素＋100μg/ml链霉素组成的培养体系适用于华南虎皮肤成纤维细胞的体外培养。     

奶牛子宫内膜上皮细胞和间质细胞的分离、培养及鉴定

为了分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞和间质细胞,给建立奶牛子宫内膜体外模型提供条件,研究采用胰蛋白酶和胶原酶消化法分离细胞,随后传代培养纯化细胞,并通过光镜观察和免疫细胞化学染色对其进行鉴别.结果表明:0.3%胰蛋白酶消化组织块1 h后可得到上皮细胞,纯度＞80%;上皮细胞呈多边型,核大而圆,具有细胞角蛋白免疫反应性.用0.1%胶原酶Ⅱ继续消化2 h,可得到间质细胞,纯度＞90%;间质细胞贴壁后可见梭形和多角形两种形态,免疫细胞化学染色显示这两种细胞均具有波形蛋白免疫反应性,而细胞角蛋白无免疫反应性,提示它们为来源于内膜基质的基质细胞,说明采用酶消化法能够成功地培养奶牛子宫内膜间质细胞和上皮细胞.     

绵羊子宫内膜上皮细胞与基质细胞培养方法的建立

为建立一种经济、简便的分离纯化培养绵羊子宫内膜上皮细胞及基质细胞的方法,采用传统组织块培养法、胰蛋白酶消化法和胰蛋白酶消化+组织块培养法,分别对绵羊子宫内膜上皮细胞与基质细胞进行了原代培养比较研究。结果表明:3种方法均可以获得原代绵羊子宫内膜上皮细胞与基质细胞。混合生长的细胞经胰蛋白酶差时消化可获得较纯上皮细胞和基质细胞,且其生长曲线均呈S型。经比较分析,胰蛋白酶消化+组织块培养法为最佳培养方法,操作简便、经济实用,获得的绵羊子宫内膜上皮细胞呈铺路石状可传3代,角蛋白18免疫细胞化学染色阳性,纯度达90%以上;基质细胞呈长梭形、漩涡状生长可有限传代,波形蛋白染色阳性,角蛋白染色阴性,纯度达95%以上。     

奶牛肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

为建立奶牛肾小管上皮细胞的原代培养、传代以及鉴定方法,本研究将肾脏皮质剪碎,并网筛过滤选取肾小管后分别进行直接培养、胶原酶1消化培养、胰蛋白酶消化培养和胰蛋白酶和0．02％EDTA混合消化培养,分别应用上述四种方法进行原代培养和传代培养,然后采用CK-18、PCK和Vimentin三种蛋白进行免疫组化鉴定奶牛肾小管上皮细胞。结果表明,采用消化培养方法都能够得到奶牛肾小管上皮细胞,但是胶原酶1消化得到的活细胞更多,能更快地成功培养奶牛肾小管上皮细胞。胶原酶1消化法是培养奶牛肾小管上皮细胞的理想培养法。     

猪呼吸道上皮细胞的体外原代培养研究

为探索猪呼吸道上皮细胞体外的原代培养,对胶原酶Ⅳ+胰酶消化法、胰酶消化法、胶原酶Ⅳ和胰酶消化结合组织块培养法以及组织块培养法等4种分离细胞的方法进行了比较,同时比较了不同浓度胎牛血清的培养基所培养细胞的纯度及成活率,采用差速贴壁法纯化细胞并对所得的上皮细胞进行冻存复苏研究。结果表明:组织块培养法培养获得的细胞数量和纯度极显著高于胰酶消化法(P0.01),胶原酶Ⅳ+胰酶消化法获得的细胞成活率显著高于胰酶消化法;含有5%血清的培养基培养的细胞成活率及纯度均高于用10%血清培养(P0.01),冻存1个月后的细胞复苏率为85%。     

鹅小肠上皮细胞的分离培养研究

取29～30胚龄的鹅胚为试验材料,通过组织块种植法和酶消化法进行原代鹅小肠上皮的体外培养,采用刮除法、相差消化及相差贴壁法对上皮细胞进行纯化,用0.05%Trypsin-EDTA进行消化传代,通过形态学观察及免疫细胞化学法进行鉴定.结果表明:组织块种植法得到的鹅小肠上皮细胞生长状况良好,细胞活性较强,经过纯化,得到了纯度较高的鹅小肠上皮细胞.而联合使用浓度为300 U/mL的胶原酶(Ⅺ型)和0.1 mg/mL的中性蛋白酶(Ⅰ型)、多次(短时间)消化收获细胞法虽然可获得大量的健全肠绒毛隐窝单位,但传代后其增殖能力明显下降;形态学观察及免疫细胞化学法鉴定为阳性,证明分离出的细胞为小肠上皮细胞,从而为小肠上皮细胞的进一步研究奠定了基础.     

鸡肠上皮细胞原代培养与鉴定

为了探讨鸡肠上皮细胞体外分离培养方法,进一步研究鸡源志贺菌Ipa C毒力蛋白在鸡肠上皮细胞上的受体蛋白分子,试验分别无菌取14,16,18日龄鸡胚肠组织,用300 U/m LⅪ型胶原酶和0.1 mg/m LⅠ型中性蛋白酶混合搅拌消化25 min,用壁差法纯化鸡肠上皮细胞,贴壁时间差为3 h,分别种植于20%FBS包被过的和未包被过的一次性塑料细胞培养瓶中,在倒置显微镜下观察细胞生长状态,透射电镜下对培养细胞进行鉴定。结果表明:采用16日龄鸡胚肠组织用Ⅺ型胶原酶和Ⅰ型中性蛋白酶联合消化25 min,可获得较多的肠隐窝单位,肠上皮细胞在20%FBS包被过的一次性细胞培养瓶中贴壁效果良好,细胞生长状态良好;透射电镜下可见鸡肠上皮细胞的微绒毛,鉴定为鸡肠上皮细胞。     

牛成纤维细胞体外分离培养方法比较及细胞特征鉴定

为了获得牛成纤维细胞最佳体外分离培养方法并建立成纤维细胞特征鉴定方法,试验采集牛耳皮肤组织块,利用眼科剪修剪成大小为0.5 ～2 mm3的组织块,分别采用组织块贴壁法、胶原酶Ⅱ+组织块黏附法、双酶消化法(胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ)+组织块黏附法进行原代牛耳成纤维细胞的分离培养,观察各方法培养的细胞生长情况,利用成纤维细胞特异...     

鸡贮精腺上皮细胞的分离及原代培养

试验旨在探讨稳定可靠的贮精腺上皮细胞分离及原代培养方法,为研究鸡贮精机理提供细胞模型。以鸡输卵管的子宫阴道交接部组织样为材料,采用酶消化法和组织块培养法分离培养母鸡贮精腺上皮细胞,观察母鸡贮精腺上皮细胞的培养情况,比较不同细胞培养方法获得贮精腺上皮细胞的生长情况。结果表明,用胶原酶或胰酶单独消化母鸡子宫阴道交接部组织,经100目过滤后获得的贮精腺上皮细胞24 h后可贴壁,但48～72 h后细胞死亡;用胶原酶Ⅺ(0.01 g/mL)与胰酶(0.25%)先后消化母鸡子宫阴道交接部组织后再经100目过滤获得的贮精腺上皮细胞贴壁性良好,24～48 h细胞出现明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,开始死亡;用组织块培养法7 d可获得鸡贮精腺上皮原代细胞,该细胞可传2～3代;用组织块培养法获得的细胞进行免疫组化试验,发现细胞表达贮精腺差异表达基因编码的NXPH1蛋白,该蛋白在培养细胞内的表达符合其分泌蛋白特性,表明组织块培养法所获细胞可用于后续研究。综上,用组织块培养法获得的鸡贮精腺上皮细胞可为研究母鸡贮精腺机制提供细胞模型。     

鸡贮精腺上皮细胞的分离及原代培养

试验旨在探讨稳定可靠的贮精腺上皮细胞分离及原代培养方法,为研究鸡贮精机理提供细胞模型。以鸡输卵管的子宫阴道交接部组织样为材料,采用酶消化法和组织块培养法分离培养母鸡贮精腺上皮细胞,观察母鸡贮精腺上皮细胞的培养情况,比较不同细胞培养方法获得贮精腺上皮细胞的生长情况。结果表明,用胶原酶或胰酶单独消化母鸡子宫阴道交接部组织,经100目过滤后获得的贮精腺上皮细胞24 h后可贴壁,但48～72 h后细胞死亡;用胶原酶Ⅺ(0.01 g/mL)与胰酶(0.25%)先后消化母鸡子宫阴道交接部组织后再经100目过滤获得的贮精腺上皮细胞贴壁性良好,24～48 h细胞出现明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,开始死亡;用组织块培养法7 d可获得鸡贮精腺上皮原代细胞,该细胞可传2～3代;用组织块培养法获得的细胞进行免疫组化试验,发现细胞表达贮精腺差异表达基因编码的NXPH1蛋白,该蛋白在培养细胞内的表达符合其分泌蛋白特性,表明组织块培养法所获细胞可用于后续研究。综上,用组织块培养法获得的鸡贮精腺上皮细胞可为研究母鸡贮精腺机制提供细胞模型。     

体外培养奶山羊乳腺上皮细胞的形态学观察

采用胶原酶和透明质酸酶组合消化法分离培养奶山羊乳腺上皮原代细胞,并通过胰蛋白酶和EDTA选择性消化法纯化奶山羊乳腺上皮细胞.建立了奶山羊乳腺上皮细胞系.显微镜下观察,培养的细胞具有典型的上皮细胞形态特征;角蛋白免疫组化染色后,呈现阳性反应.     

小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究

通过组织块培养法进行胎鼠原代细胞培养,采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代对小鼠小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定.结果表明:组织块培养法得到了小鼠生长状况良好的细胞,经过纯化,得到了较纯的小肠上皮细胞;形态学观察和免疫组化检测显示得到的细胞为小鼠上皮细胞.用组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,并能进行传代纯化,通过免疫组化鉴定,证明分离出的小鼠EEC为阳性,即为小肠上皮细胞.     

猫子宫内膜上皮细胞的分离培养与生物学特性

为了分离、纯化、培养猫子宫内膜上皮细胞并分析其生物学特性,本试验采用胰蛋白酶消化法+组织块培养法,于体外分离和培养子宫内膜上皮细胞,并采用免疫荧光法对其进行鉴定;测定第3代(P3)细胞生长曲线和群体倍增时间,比较P3和P6细胞克隆形成率。结果显示：猫子宫内膜上皮细胞呈典型铺路石状,细胞角蛋白染色呈阳性,符合内膜上皮细胞特征;P3细胞生长曲线呈典型S型;P3子宫内膜上皮细胞群体倍增时间为(22.73±2.05) h,其克隆形成率极显著高于P6(P<0.01)。结果表明：本试验采用胰蛋白酶消化法+组织块培养法分离获得的猫子宫内膜上皮细胞具有良好的体外增殖能力。     

小鼠小肠上皮细胞的分离培养研究

通过组织块培养法进行胎鼠原代细胞培养,采用刮除法和相差消化及相差贴壁法对细胞进行纯化,用0.05%的胰蛋白酶进行消化传代对小鼠小肠上皮细胞进行了原代分离培养、传代、纯化及鉴定。结果表明:组织块培养法得到了小鼠生长状况良好的细胞,经过纯化,得到了较纯的小肠上皮细胞;形态学观察和免疫组化检测显示得到的细胞为小鼠上皮细胞。用组织块培养可以分离纯化出增殖能力较强的上皮细胞,并能进行传代纯化,通过免疫组化鉴定,证明分离出的小鼠IEC为阳性,即为小肠上皮细胞。