牛成纤维细胞体外分离培养方法比较及细胞特征鉴定

为了获得牛成纤维细胞最佳体外分离培养方法并建立成纤维细胞特征鉴定方法,试验采集牛耳皮肤组织块,利用眼科剪修剪成大小为0.5 ～2 mm3的组织块,分别采用组织块贴壁法、胶原酶Ⅱ+组织块黏附法、双酶消化法(胰蛋白酶+胶原酶Ⅱ)+组织块黏附法进行原代牛耳成纤维细胞的分离培养,观察各方法培养的细胞生长情况,利用成纤维细胞特异...     

猪小肠黏膜上皮细胞原代培养

分别采用酶消化法和组织块培养法,建立了猪小肠黏膜上皮细胞原代培养的方法。酶消化法于37℃分为4个处理组进行。处理1以2.5 g/L的胰蛋白酶消化30 min;处理2以2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min;处理3以50 mg/L嗜热菌蛋白酶消化50 min;处理4以50 mg/L嗜热菌蛋白酶+2.0 g/L胶原酶Ⅰ消化70 min。采用柠檬酸胰酶法分离纯化细胞。结果表明,组织块法原代培养获得的细胞活性较强。     

东方田鼠与昆明小鼠胚胎成纤维细胞体外分离和培养比较研究

为了进一步从细胞水平深入研究东方田鼠抗日本血吸虫机制提供试验材料,以及经济可靠地保存野生东方田鼠的生物活性细胞,试验采用胰蛋白酶消化法和组织块贴壁法,分别取妊娠12 d的东方田鼠和昆明小鼠胚胎组织,体外分离、培养成纤维细胞,观察比较不同培养方法、胰蛋白酶浓度、消化时间、传代次数及冻存复苏等因素对分离和培养两种胚胎成纤维细胞的影响,实时观察比较两种细胞生长特性。结果表明:组织块贴壁法和胰蛋白酶消化法均能在体外条件下较好地分离、培养两种胚胎成纤维细胞;采用0.125%胰蛋白酶37℃消化组织10 min,分离的细胞普遍密度大、活力好、贴壁细胞多、速度快,是实验室分离12 d胎龄东方田鼠与小鼠胚胎组织最佳胰酶浓度;昆明小鼠胚胎成纤维细胞较东方田鼠胚胎成纤维细胞足丝长而明显,细胞核较小;两种细胞冻存后生长及活率无显著差异;在含10%血清浓度培养体系中,东方田鼠胚胎成纤维细胞生长速率慢于昆明小鼠胚胎成纤维细胞,生理代数分别为8代和7代,其中2～5代增殖旺盛。说明东方田鼠和昆明小鼠胚胎成纤维细胞在体外分离方法上差异不显著,而两者在生物学特性方面存在一定种属差异。     

猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞培养方法的研究

为了研究猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞的分离培养体系,根据取样组织的不同,筛选出最佳的培养方法,试验以猪胎儿和耳皮肤为试验材料,用4种不同的培养分离方法,即胰酶热消化法、胰酶冷热结合消化法、胰酶室温消化法和组织块培养法,分离培养猪胎儿成纤维细胞和耳皮肤成纤维细胞,对比培养效果,筛选出最佳的培养方法。结果表明:胰酶室温消化法分离的猪胎儿成纤维细胞存活率显著高于胰酶热消化法和胰酶冷热结合消化法(P<0.05),细胞贴壁效果好,且操作简单;猪耳皮肤成纤维细胞原代培养中,胰酶热消化法和胰酶室温消化法分离的细胞数量少,组织块培养法所需的组织量少,且较胰酶冷热结合消化法操作简单。试验中培养的细胞呈典型的成纤维细胞形态,生长曲线呈"S"型,经冻存复苏后生长状态良好,说明胰酶室温消化法是猪胎儿成纤维细胞较好的培养方法,胰酶热消化法和胰酶室温消化法是猪耳皮肤成纤维细胞原代培养的理想培养方法。     

陆川猪耳部成纤维细胞的体外培养

本研究建立陆川猪耳部成纤维细胞的体外培养体系,采用组织块培养法可以获得陆川猪耳部成纤维细胞。用0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA消化液消化细胞、用含有10%FBS的DMEM对细胞进行培养,能很好的支持陆川猪耳部成纤维细胞的生长。传3代后,观察到培养的细胞形态逐渐均一,为典型的成纤维细胞,绝大部分呈梭形或不规则三角形...     

C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养与纯化鉴定

为了建立一种易于操作,能够获得高纯度、高活力C57BL/6小鼠胚胎成纤维细胞的分离培养体系,并对分离提取的细胞进行纯化鉴定,试验在无菌环境下取E12.5胎鼠皮肤,剪碎至1 mm2大小,均匀铺于皿中,用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基连续培养4 d,以胰蛋白酶消化-再贴壁法分离纯化目的细胞,分别以NIH3T3、角质形成性细胞作为阳性与阴性对照,采用免疫荧光、Western-blot检测Vimentin及Keratin的表达情况,以鉴定所分离的细胞及其纯度。结果表明:组织块培养24 h即可见成纤维样细胞爬出,培养96 h细胞生长爬满全皿,经胰酶消化、筛网过滤再贴壁接种后能够获得形态均一、活力旺盛、具有成纤维细胞形态学特征的目的细胞;所分离细胞Vimentin表达阳性率为100%,而Keratin表达阳性率为0;与阴性对照角质形成性细胞相比,C57BL/6分离成纤维细胞和NIH3T3细胞均高表达Vimentin,且差异极显著,有统计学意义。说明以E12.5胎鼠皮肤为材料建立成纤维细胞分离培养体系,所分离培养的成纤维细胞具有更高的细胞活力和细胞纯度。     

早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞分离培养与鉴定

为了建立早胜牛胚胎和耳缘成纤维细胞体外分离培养体系,采用植块法和酶消化法制备这两种组织成纤维细胞。结果显示,用植块法制备了耳缘成纤维细胞,组织块直径较小的成活率较高且生长速度较快;用酶消化法制备了胚胎和耳缘两种组织成纤维细胞,复苏后细胞的存活率:胚胎(96.8%)＞耳(94.7%)。2种组织成纤维细胞生长曲线均呈"S"型,胚胎组织(倍增时间29.7 h)生长速度快于耳组织(倍增时间31.2 h)。用免疫组织化学染色鉴定证实,分离培养的成纤维细胞中间丝被染成棕黄色,波形蛋白呈阳性反应。     

鸡胚小肠上皮细胞的分离及原代培养研究

<正>取18日龄的SPF鸡胚,分别采用组织块培养法、胰蛋白酶、胶原酶I和嗜热菌蛋白酶消化法分离和体外培养小肠上皮细胞。结果表明:组织块培养法所获得的上皮细胞纯度较低;胰蛋白酶消化后多为单细胞,细胞贴壁和生长能力较弱;胶原酶Ⅰ单独消化50min或嗜热菌蛋白酶单独消化110min以及胶原酶Ⅰ、嗜热菌蛋白酶联     

银狐垂体细胞系构建研究

分别采用组织块法和消化法2种接种方法进行银狐垂体细胞系构建研究。在消化法中使用不同浓度的胰蛋白酶来检验效果,同时在原代培养期使用反复差速贴壁法纯化,传代培养期结合使用反复差速贴壁以及两步消化法进行处理。结果表明：组织块法接种后成纤维细胞生长明显,原代培养后期成纤维细胞已为主要细胞;降低胰蛋白酶浓度能降低对细胞损伤,但消化时间会增长;采用消化法接种在抑制成纤维细胞生长方面效果好于组织块法。纯化效果上,结合反复差速贴壁法与两步消化法处理后获得了较好的效果,在原代培养时期能较好去除成纤维细胞并通过持续使用该方法可在传二代后获得较高纯度的细胞,纯度能达到80%以上,能够建立细胞系。     

奶牛子宫内膜上皮细胞和间质细胞的分离、培养及鉴定

为了分离培养奶牛子宫内膜上皮细胞和间质细胞,给建立奶牛子宫内膜体外模型提供条件,研究采用胰蛋白酶和胶原酶消化法分离细胞,随后传代培养纯化细胞,并通过光镜观察和免疫细胞化学染色对其进行鉴别.结果表明:0.3%胰蛋白酶消化组织块1 h后可得到上皮细胞,纯度＞80%;上皮细胞呈多边型,核大而圆,具有细胞角蛋白免疫反应性.用0.1%胶原酶Ⅱ继续消化2 h,可得到间质细胞,纯度＞90%;间质细胞贴壁后可见梭形和多角形两种形态,免疫细胞化学染色显示这两种细胞均具有波形蛋白免疫反应性,而细胞角蛋白无免疫反应性,提示它们为来源于内膜基质的基质细胞,说明采用酶消化法能够成功地培养奶牛子宫内膜间质细胞和上皮细胞.     

牦牛乳腺上皮细胞的体外分离培养及鉴定

为提高牦牛乳腺上皮细胞体外培养成功率,实现高度可重复性,试验采用2.5 g/L(含0.5 g/L EDTA)胰酶和Ⅰ型胶原酶(1 mg/mL)分段消化牦牛乳腺组织块以分离细胞,原代培养时于DMEM/F12培养体系内添加氢化可的松(1μg/mL)、表皮生长因子(50 ng/mL)及胰岛素-转铁蛋白-硒(5μg/mL),传代时用牦牛乳腺上皮细胞与成纤维细胞对胰酶敏感度及贴壁时间的差异特性进行纯化。采用CCK8法测定细胞生长曲线,细胞免疫荧光技术鉴定细胞分子表型,Western blot技术对细胞进行功能鉴定。结果显示,组合酶分段消化法可获得较多细胞量,激素添加有利于促进细胞贴壁及增殖,分离纯化后的细胞具有正常生长特性,经分子表型及功能鉴定纯化后的细胞可阳性表达角蛋白18及β-酪蛋白,阴性表达角蛋白14及波形蛋白,上述3种激素存在时,细胞可在蛋白质水平表达β-酪蛋白,催乳素可促进其表达,说明成功培养了具有泌乳功能的牦牛乳腺上皮细胞,建立了有效的牦牛乳腺上皮细胞体外培养技术体系,可为以后的相关研究提供参考。     

手工克隆小鼠胚胎的研究

与传统克隆相比,手工克隆使用较为简单的仪器设备和技术操作即可生产克隆动物。小鼠作为模式实验动物在多领域得以应用。本研究中采用杂交胎鼠细胞系提供核供体细胞,在含细胞松弛素(Cytochalasin B,CB)和链蛋白酶(Pronase)及2%血清的M199 hepes缓冲液滴(CBMP)中消化透明带并切割去核,电融合后1 h,重构胚置于含Sr Cl2及CB(5μg/m L)的无钙体外培养液(Ca2+-free IVC)中激活6 h,体外培养液(IVC)中清洗3遍后,移入WOW系统培养,培养至小鼠HMC囊胚阶段。研究发现:1)CBMP液中Pronase的浓度相比20μg/m L和100μg/m L,卵母细胞透明带在10μg/m L组需要更长时间消化至消失,较有利于操作;2)直流电(DC)80 V,持续40μs,融合率达60%。3)含10 mmol/L Sr Cl2的化学激活液处理的重构胚与5mmol/L组相比,囊胚更高(29±3%∶13±3%,P0.05),差异显著;4)两种体外培养液,CZB与m PZM,在IVC囊胚率上无显著差异(29±3%∶24±5%,P0.05),而使用CZB可获得较高的囊胚率。本实验首次采用HMC方法体外条件下生产小鼠克隆胚胎,通过摸索透明带消化时间、电激活参数、化学激活试剂及培养液,尝试小鼠体外生产克隆胚胎的新方法,并取得了初步成果,技术优化及效率提高问题仍需要更进一步的研究。     

Study on in vitro Culture of Donkey Skin Fibroblasts

This study was aimed to compare different culture methods for donkey skin fibroblasts to establish a highly efficient and rapid culture system. The dermal tissue of the healthy and 6-7 year old Xinjiang donkey was cultured for primary cells of skin fibroblast with tissue explants adherent method and double enzyme digestion method. Then,the growth characteristics,proliferation,cell cycle and mycoplasma contamination were detected and analyzed. The results showed that the fibroblast cells entered the logarithmic growth phase after cultured for 3 days by double enzyme digestion(0.25% trypsin digestion for 1 h and then 0.5% collagenase Ⅰ for 6 h), while it required 15 days with tissue explants adherent method. Flow cytometry analysis showed that nearly half of the cells were in G0/G1 stage,the other half in S+G2+M stage, while just 5.17% of the cells were apoptosis,which indicated that most of the cells were in the active stage of division and proliferation,and had strong vitality. Moreover, there was no mycoplasma contamination in the cultured cells. In summary,the culture system of donkey skin fibroblasts was rapidly and effectively established with the double enzyme digestion method in vitro.     

驴皮成纤维细胞的体外培养研究

试验旨在比较不同培养方法对驴皮成纤维细胞培养的效果,以便建立其体外高效快速的培养体系。采集6~7岁健康的新疆驴真皮组织,分别用组织块贴壁法和双酶消化法对驴皮成纤维细胞进行原代培养,并检测分析细胞的生长特点、生长速度、细胞周期与支原体污染等指标。结果显示,双酶消化法（0.25%胰酶处理1 h,再用0.5%胶原蛋白酶Ⅰ处理6 h）培养驴皮组织3 d后,成纤维细胞进入了对数增殖期,而组织块贴壁法则需要15 d;细胞周期经流式分析发现,处于G0/G1期与S+G2+M期的细胞均约为50%,其余5.17%细胞处于凋亡期,表明大多细胞处于分裂增殖的活跃期,细胞具有很强的活力;试验中培养的细胞均无支原体污染。综上,应用双酶消化法可快速、高效地建立驴皮成纤维细胞体外培养体系。     

不同消化酶对羊驼皮肤黑素细胞分离的影响

本研究旨在探讨羊驼皮肤黑素细胞的分离、培养及鉴定方法,为进一步研究色素沉积提供合适的细胞模型。取1~3岁的青年羊驼皮肤,用胰酶、胰酶∶EDTA、DispaseⅡ酶3种不同的消化酶消化羊驼皮肤,再用胰酶∶EDTA消化,分离得到羊驼黑素细胞,接种于多种促进黑素细胞生长的营养成分DMEM/F12培养基中,通过观察黑素细胞的生长、细胞接种数和细胞贴壁数检验黑素细胞的纯度。结果表明,DispaseⅡ组处理的羊驼皮肤,分离得到的黑素细胞明显多于其它2个组(P＜0.01)。综上所述,选用DispaseⅡ酶作为分离羊驼皮肤的消化酶,可获得较纯的黑素细胞。     

组织块再移法分离培养奶山羊乳腺上皮细胞

通过比较组织块贴壁培养法、组织块再移法、胰蛋白酶消化法、胶原酶Ⅱ消化法和胶原酶消化配合组织块贴壁法分离、培养、纯化山羊乳腺上皮细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间,研究乳腺上皮细胞培养效果。结果显示,利用胶原酶消化配合组织块贴壁法不能获得正常生长的乳腺上皮细胞;利用组织块贴壁培养法、组织块再移法和胶原酶Ⅱ消化法获得大量的乳腺上皮细胞,所得到的上皮细胞生长曲线呈典型的＂S＂型,符合细胞生长的一般规律。组织块再移法不仅可快速获得大量纯化的乳腺上皮细胞,而且所得到的细胞经传代后,细胞群体倍增时间最短、增殖能力最强,表明,该法是获得山羊乳腺上皮细胞最适宜的方法。     

华南虎皮肤感染的诊治

由于南方雨水较多,气候温暖潮湿,细菌相对活跃,诱发韶关2只华南虎（Panthera tigris amoyensis）皮肤感染。2013年2月23日,发现506号雄性华南虎臀部两侧及后腿内侧成片（块状）脱毛和断毛,脱毛部位皮肤较红,湿疹状,初诊为细菌性感染。8月18日,发现470号雄性华南虎行走艰难,后脚趾间溃烂发炎,初诊为真菌感染。作者针对2例皮肤感染病症,采取口服和外用广谱消炎杀菌药物,加强虎舍杀菌消毒等治疗和卫生措施,使患虎3 d内病情得到有效控制,10 d后病情基本痊愈,30 d后皮毛恢复正常。此外,本文还对患虎致病原因进行了分析研究,并提出了预防措施。     

高效液相色谱-电喷雾串联质谱法直接测定蜂蜜中脯氨酸

建立了高效液相色谱一电喷雾串联质谱法直接测定蜂蜜中脯氨酸的方法。蜂蜜样品用去离子水溶解后,过0．45μm水相微孔滤膜,高效液相色谱一电喷雾串联质谱进行分析检测。以Phenomenex C18（100mmx4．6mmx2．6μm）色谱柱为分析柱,乙腈和0．1％（v／v）甲酸-5mmol／L乙酸铵水溶液为流动相进行梯度洗脱,在电喷雾正离子多反应监测模式下进行检测,外标法定量。通过加标验证,该方法检测低限可达25mg／kg,脯氨酸在0．5～10．0μg／mL浓度范围内线性关系良好,相关系数大于0．99。在25、50和100mg/kg三个加标水平下,蜂蜜中脯氨酸平均回收率为83．7～109．6％,相对标准偏差（RSD）为2．4～10．9％。该方法样品处理简单、快速,结果准确,灵敏度高,可以作为日常蜂蜜中脯氨酸的检测方法。     

鸡贮精腺上皮细胞的分离及原代培养

试验旨在探讨稳定可靠的贮精腺上皮细胞分离及原代培养方法,为研究鸡贮精机理提供细胞模型。以鸡输卵管的子宫阴道交接部组织样为材料,采用酶消化法和组织块培养法分离培养母鸡贮精腺上皮细胞,观察母鸡贮精腺上皮细胞的培养情况,比较不同细胞培养方法获得贮精腺上皮细胞的生长情况。结果表明,用胶原酶或胰酶单独消化母鸡子宫阴道交接部组织,经100目过滤后获得的贮精腺上皮细胞24 h后可贴壁,但48～72 h后细胞死亡;用胶原酶Ⅺ(0.01 g/mL)与胰酶(0.25%)先后消化母鸡子宫阴道交接部组织后再经100目过滤获得的贮精腺上皮细胞贴壁性良好,24～48 h细胞出现明显增殖,72 h后细胞增殖速度减慢,开始死亡;用组织块培养法7 d可获得鸡贮精腺上皮原代细胞,该细胞可传2～3代;用组织块培养法获得的细胞进行免疫组化试验,发现细胞表达贮精腺差异表达基因编码的NXPH1蛋白,该蛋白在培养细胞内的表达符合其分泌蛋白特性,表明组织块培养法所获细胞可用于后续研究。综上,用组织块培养法获得的鸡贮精腺上皮细胞可为研究母鸡贮精腺机制提供细胞模型。     

奶牛肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

为建立奶牛肾小管上皮细胞的原代培养、传代以及鉴定方法,本研究将肾脏皮质剪碎,并网筛过滤选取肾小管后分别进行直接培养、胶原酶1消化培养、胰蛋白酶消化培养和胰蛋白酶和0．02％EDTA混合消化培养,分别应用上述四种方法进行原代培养和传代培养,然后采用CK-18、PCK和Vimentin三种蛋白进行免疫组化鉴定奶牛肾小管上皮细胞。结果表明,采用消化培养方法都能够得到奶牛肾小管上皮细胞,但是胶原酶1消化得到的活细胞更多,能更快地成功培养奶牛肾小管上皮细胞。胶原酶1消化法是培养奶牛肾小管上皮细胞的理想培养法。