猫血清白蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

【目的】 在毕赤酵母中构建猫血清白蛋白（feline serum albumin,FSA）表达系统,并探索其最适的基本表达条件,为FSA的生产提供一种新方法。【方法】 在GenBank上获取FSA碱基序列,进行密码子优化并合成,将优化的密码子构建到载体pPIC9K上,经PCR和双酶切验证后通过电击转化将重组质粒FSA-pPIC9K转化毕赤酵母GS115,依次经MD平板和G418筛选后进行菌落PCR获得阳性菌株,随机选取阳性菌株经甲醇诱导表达96 h后,取表达上清液进行Western blotting验证。选取表达量较高的菌株分别在不同温度（24、26、28和30 ℃）、pH （4.0、5.0、6.0、7.0和8.0）和甲醇诱导量（其中1组为每24 h添加0.5%,其余4组为每12 h分别添加0.5%、1.0%、1.5%和2.0%）的条件下诱导表达96 h,取表达上清液进行Western blotting验证。【结果】 菌落PCR结果显示,获得2条大小分别约为2.3和2.2 kb的目的基因条带和毕赤酵母AOX1基因扩增条带,诱导表达96 h后取表达上清液进行Western blotting验证,在70 ku左右出现特异性条带。通过基本条件优化发现该蛋白在28 ℃,pH为6.0且每12 h添加0.5%的甲醇条件下表达量较高。【结论】 毕赤酵母GS115可稳定表达FSA。     

miRNA调节卵泡颗粒细胞凋亡及其机制的研究进展

微小核糖核酸(microRNA,miRNA)是一类内源性非编码RNA,具有广泛的基因表达调控作用,可以在转录后水平通过影响靶基因来调控相应蛋白质的表达,进而调节细胞的生命活动。miRNA在哺乳动物卵泡颗粒细胞中表达,并调控颗粒细胞的凋亡。颗粒细胞作为卵巢卵泡中数量最多的细胞群,在卵泡发育过程中起着至关重要的作用,不仅为卵母细胞提供营养物质,还调控其发育和成熟。颗粒细胞凋亡是导致卵泡闭锁的重要原因,影响卵泡的数量和质量从而影响雌性动物的繁殖性能。颗粒细胞凋亡过程受多种因素的调控。文章简述了miRNA对卵巢颗粒细胞凋亡的调控作用及其机制,其中包括miRNA通过调控激素分泌和细胞凋亡相关因子的表达进而调节颗粒细胞的凋亡,miRNA对颗粒细胞凋亡相关信号通路的影响,miRNA调控颗粒细胞凋亡导致的卵巢相关疾病,并总结了对颗粒细胞凋亡有调控作用的miRNA,以及miRNA在疾病诊断和治疗中的潜在作用,以期为后续相关卵巢疾病的发病机制和治疗方案研究,以及提高雌性哺乳动物生殖性能提供指导和参考。     

α-酮戊二酸二甲酯预处理对犬脂肪间充质干细胞氧化应激损伤的保护作用

研究旨在探究α-酮戊二酸二甲酯(dimethyl α-ketoglutarate,DMKG)预处理对犬脂肪间充质干细胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADSCs)抗氧化应激损伤的影响。以含0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L过氧化氢(H₂O₂)的DMEM/F12基础培养基处理犬ADSCs,1 h后采用CCK-8法检测细胞存活率,筛选最适浓度以建立犬ADSCs氧化应激模型。选取生长良好的P3代犬ADSCs分为3组,分别为空白对照组、模型组、DMKG组。空白对照组正常培养,不作处理;模型组使用最佳浓度的H₂O₂溶液处理犬ADSCs 1 h;DMKG组使用1 mmol/L DMKG预处理犬ADSCs 24 h后,使用最佳浓度的H₂O₂溶液处理犬ADSCs 1 h。培养结束后,采用CCK-8法检测各组的细胞存活率,可见分光光度法检测还原型谷胱甘肽含量,荧光探针DCFH-DA检测活性氧水平,Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR检测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、抗凋亡相关基因Bcl-2和促凋亡相关基因Bax、Cleaved-Caspase3的mRNA表达水平。结果显示,与模型组相比,DMKG预处理能有效减少细胞内活性氧的产生(P<0.05),增加细胞存活率(P<0.01),并抑制细胞凋亡(P<0.05);同时,DMKG预处理可增加还原型谷胱甘肽含量(P<0.01),上调相关抗氧化酶基因SOD1、SOD2(P<0.01)和CAT(P<0.05),下调凋亡基因Cleaved-Caspase3的表达水平(P<0.05),增加Bcl-2/Bax的比值(P<0.05)。综上所述,DMKG预处理可显著提高犬ADSCs抗氧化、抗凋亡的能力,从而增加犬ADSCs在氧化应激条件下的存活。     

2007至2020年浙江省动物源细菌耐药性监测进展

畜禽养殖中抗生素滥用造成动物源耐药细菌大量产生与传播,已经成为重点关注的公共安全问题。我国细菌耐药情况较为严重,对于动物源细菌耐药性关注度亟待加强。本文将从浙江省近年动物源大肠埃希菌、弗格森埃希菌、沙门菌、弯曲杆菌、肠球菌及葡萄球菌的分离情况、耐药情况以及所发现的获得性耐药基因方面进行综述,为畜禽养殖行业的科学合理用药提供理论指导,完善动物源细菌耐药监测网,为抗菌药减量化行动提供依据,以期更好地遏制浙江省动物源细菌耐药性问题。     

犬UC-MSC-Exo来源miRNA表达分析及其cfa-miR-34a/-143对血管内皮细胞增殖的影响

试验旨在分离鉴定犬脐带间充质干细胞分泌的外泌体（UC-MSC-Exo）,并研究犬UC-MSC-Exo来源miRNA的表达情况及其对血管内皮细胞（VEC）增殖的影响。采用超高速离心法从犬脐带间充质干细胞培养上清中分离外泌体,采用Western blotting、透射电镜和纳米颗粒跟踪分析法（NTA）进行鉴定。通过对犬UC-MSC-Exo中的miRNA进行测序,筛选出2个目标miRNA（cfa-miR-34a和cfa-miR-143）并合成相应的mimic和inhibitor,转染犬VEC;采用荧光显微镜和实时荧光定量PCR法检测mimic和inhibitor转染情况及其转染效率;CCK-8法检测转染mimic和inhibitor对犬VEC增殖能力的影响,并对其靶基因进行预测。结果显示,犬UC-MSC-Exo表达特异性的外泌体表面蛋白CD9、CD63和CD81,粒径集中在100~200 nm,电镜检测成典型的杯状。免疫荧光结果表明,miRNA mimic和inhibitor均已转染进细胞内,并且聚集于细胞质中;实时荧光定量PCR结果表明,转染cfa-miR-34a mimic和cfa-miR-143 mimic后,细胞内cfa-miR-34a和cfa-miR-143表达量分别升高约400和78倍;而转染cfa-miR-34a inhibitor和cfa-miR-143 inhibitor后,细胞内cfa-miR-34a和cfa-miR-143表达量分别降低了77%和83%;CCK-8检测结果表明,cfa-miR-34a和cfa-miR-143在体外可极显著促进血管内皮细胞的增殖（P<0.01）。cfa-miR-34a靶基因预测结果发现,共有195个保守靶位点,与miRDB预测结果共有69个交集靶基因;cfa-miR-143则有448个保守靶基因,其与miRDB预测结果有128个交集靶基因。本试验成功分离得到犬UC-MSC-Exo,且证实目标miRNA cfa-miR-34a和cfa-miR-143在体外可极显著促进VEC增殖。     

重组蛋白H-NS对胸膜肺炎放线杆菌生物被膜形成的影响

在筛选胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacills pleuropneumoniae,APP)转座突变体库时,发现hns基因缺失突变可显著增强APP血清l型生物被膜的形成,该基因编码一种DNA结合蛋白(组蛋白样类核结构蛋白,H-NS).为了进一步研究H-NS对APP生物被膜形成的影响,实验以APP血清l型4074株基因组DNA为模板,PCR扩增了408 bp的hns基因编码区,并克隆到原核表达载体pET-28c中获得重组质粒pET28c-hns,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导表达和组氨酸亲和层析柱纯化获得大小约19 kD的重组蛋白rH-NS.将不同浓度的rH-NS添加到hns突变株1-21及其亲本菌株4074的培养基中,用微孔板法测定生物被膜的形成.结果显示,在不添加rH-NS时,4074株不能形成可见的生物被膜,而1-21株形成明显的生物被膜;在添加0.1～0.3μmol/L rH-NS的情况下,1-21株生物被膜的形成昔随着rH-NS浓度的升高而降低.而4074株随着rH-NS浓度的升高而升高;rH-NS添加量超过0.4 μmol/L对两个菌株生物被膜形成未见明显影响.结果表明H-NS蛋白负调控APP生物被膜的形成,并呈现一定的剂量效应.     

禽源致病性大肠杆菌的耐药性和毒力基因研究

为了解广东省佛山市禽源致病性大肠杆菌抗生素敏感性及其毒力因子携带情况,采集疑似禽大肠杆菌患病禽的肝脏和肺脏病料,用于禽源致病性大肠杆菌的分离培养、形态学观察、生化鉴定,并运用药敏片检测菌株对13种抗菌药的体外敏感性,采用PCR方法调查了9种毒力因子携带情况。结果显示:108株分离株的生化特性基本一致;所有菌株均具有5种以上的药物耐受性,95%以上对阿莫西林、氯霉素和头孢氨苄耐受,56.48%以上菌株对所检测的12种抗菌药耐受;分离株pap C和vat基因的检出率最低分别为2.78%和5.56%,分布率最高的基因为iuc D(74.07%)、iss(62.96%)、tsh(56.48%)和hly F(55.56%);耐药性和毒力之间的分析结果表明,25%的菌株是含有5种以上毒力基因的强毒株,强毒株中66.67%的菌株对12种抗菌药耐受。     

猫子宫内膜上皮细胞的分离培养与生物学特性

为了分离、纯化、培养猫子宫内膜上皮细胞并分析其生物学特性,本试验采用胰蛋白酶消化法+组织块培养法,于体外分离和培养子宫内膜上皮细胞,并采用免疫荧光法对其进行鉴定;测定第3代(P3)细胞生长曲线和群体倍增时间,比较P3和P6细胞克隆形成率。结果显示：猫子宫内膜上皮细胞呈典型铺路石状,细胞角蛋白染色呈阳性,符合内膜上皮细胞特征;P3细胞生长曲线呈典型S型;P3子宫内膜上皮细胞群体倍增时间为(22.73±2.05) h,其克隆形成率极显著高于P6(P<0.01)。结果表明：本试验采用胰蛋白酶消化法+组织块培养法分离获得的猫子宫内膜上皮细胞具有良好的体外增殖能力。     

重组H-NS蛋白对胸膜肺炎放线杆菌生物被膜形成的影响

摘要：胸膜肺炎放线杆菌（APP）是重要的猪呼吸道病原菌,给世界养猪业造成严重的经济损失。生物被膜在许多细菌的感染与致病过程中起重要作用。我们在筛选APP转座突变体库时,发现hns基因缺失突变可显著增强APP血清1型生物被膜的形成,该基因编码一种DNA结合蛋白（组蛋白样类核结构蛋白）。为了进一步研究H-NS蛋白对APP生物被膜形成的影响,本文以APP血清1型4074株基因组DNA为模板,PCR扩增了408bp的hns基因编码区,克隆到原核表达载体pET-28c中获得重组质粒pET-hns,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和组氨酸亲和层析柱纯化获得大小约19KDa的重组蛋白rH-NS。将不同浓度的rH-NS添加到hns突变株1-21及其亲本菌株4074的培养基中,用微孔板法测定生物被膜的形成。结果显示,在不添加rH-NS时,4074株不能形成可见的生物被膜,而1-21株形成明显的生物被膜;在添加0.1-0.3μM的rH-NS的情况下,1-21株生物被膜的形成量随着rH-NS浓度的升高而降低,而4074株随着rH-NS浓度的升高而升高;rH-NS添加量超过0.4μM对两个菌株生物被膜形成未见明显影响。结果表明H-NS蛋白负调控APP生物被膜的形成,并呈现一定的剂量效应。     

胸膜肺炎放线杆菌地方分离株和参考菌株的生物被膜形成

通过玻璃试管和聚苯乙烯微孔板结晶紫染色法分别对胸膜肺炎放线杆菌(APP)的15个血清型国际参考菌株和22个中国地方分离菌株在体外形成生物被膜的能力进行了定性和定量分析.在15个血清型(无14型)的参考菌株中,只有5b、6和11型能在聚苯乙烯微孔板上形成生物被膜;而59%的地方分离株(涵盖13种血清型,无14和15型)在聚苯乙烯微孔板上表现出产生生物被膜的能力.结果表明,大多数血清型的APP能在体外形成生物被膜,尤其在地方分离株中更普遍;与低毒力血清型的菌株相比,高毒力和中等毒力血清型的菌株更倾向于形成生物被膜.