犬UC-MSC-Exo来源miRNA表达分析及其cfa-miR-34a/-143对血管内皮细胞增殖的影响

试验旨在分离鉴定犬脐带间充质干细胞分泌的外泌体（UC-MSC-Exo）,并研究犬UC-MSC-Exo来源miRNA的表达情况及其对血管内皮细胞（VEC）增殖的影响。采用超高速离心法从犬脐带间充质干细胞培养上清中分离外泌体,采用Western blotting、透射电镜和纳米颗粒跟踪分析法（NTA）进行鉴定。通过对犬UC-MSC-Exo中的miRNA进行测序,筛选出2个目标miRNA（cfa-miR-34a和cfa-miR-143）并合成相应的mimic和inhibitor,转染犬VEC;采用荧光显微镜和实时荧光定量PCR法检测mimic和inhibitor转染情况及其转染效率;CCK-8法检测转染mimic和inhibitor对犬VEC增殖能力的影响,并对其靶基因进行预测。结果显示,犬UC-MSC-Exo表达特异性的外泌体表面蛋白CD9、CD63和CD81,粒径集中在100~200 nm,电镜检测成典型的杯状。免疫荧光结果表明,miRNA mimic和inhibitor均已转染进细胞内,并且聚集于细胞质中;实时荧光定量PCR结果表明,转染cfa-miR-34a mimic和cfa-miR-143 mimic后,细胞内cfa-miR-34a和cfa-miR-143表达量分别升高约400和78倍;而转染cfa-miR-34a inhibitor和cfa-miR-143 inhibitor后,细胞内cfa-miR-34a和cfa-miR-143表达量分别降低了77%和83%;CCK-8检测结果表明,cfa-miR-34a和cfa-miR-143在体外可极显著促进血管内皮细胞的增殖（P<0.01）。cfa-miR-34a靶基因预测结果发现,共有195个保守靶位点,与miRDB预测结果共有69个交集靶基因;cfa-miR-143则有448个保守靶基因,其与miRDB预测结果有128个交集靶基因。本试验成功分离得到犬UC-MSC-Exo,且证实目标miRNA cfa-miR-34a和cfa-miR-143在体外可极显著促进VEC增殖。     

犬脐带间充质干细胞抗关节炎炎症反应的研究

为研究犬脐带间充质干细胞(UC-MSCs)抗膝关节炎炎症反应的效果,本文首先通过手术打磨膝关节软骨的方式建立犬关节炎模型,造模后第1天和第3天将异体UC-MSCs悬液注入治疗组犬的膝关节腔内,而模型组注入等量生理盐水,然后测定试验犬体温、血常规与生化指标以及炎性因子。结果发现,试验后前11d模型组犬体温高于治疗组;在试验期间,模型组的白细胞总数和嗜中性粒细胞数显著高于治疗组(P 0. 05),而淋巴细胞、红细胞、血红蛋白和血小板数量则显著低于治疗组(P 0. 05);模型组的血生化指标除了ALP在7 d时极显著高于治疗组(P 0. 01)外,其他生化指标两组间均无显著差异;模型组血液中的IL-6、IL-7和TNF-α等炎性因子显著高于治疗组(P 0. 05)。以上结果提示,UC-MSC移植能明显抑制关节损伤导致的炎症反应。