猪繁殖与呼吸综合征病毒HS株结构蛋白基因的克隆与序列分析

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株(VR-2332)基因序列,设计合成了ORF2a、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的引物.利用RT-PCR扩增出PRRSV HS株各基因的cDNA片段,将扩增的各cDNA片段克隆入pMD18-T载体并测序.应用DNA Man软件,将测序结果与国内外已发表野毒株和疫苗株(VR-2332、Resp MLV、16244B、HN1、BJ-4、CH1-a、HB-1、HB-2、LV)的相应基因进行序列比较,并绘制系统进化树.结果表明,PRRSV HS株与美洲型的相应基因核苷酸同源性为83.6%～99.7%,与LV株的相应基因核苷酸同源性为38.9%～49%;推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为86.6%～99.6%,与LV株的同源性为54.2%～78.2%.系统进化树表明,PRRSV HS株属于美洲型,与HN1、VR-2332、RespMLV、16244B、BJ-4亲缘关系较近.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒变异株ORF6基因的克隆与原核表达研究

根据GenBank中美洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF6基因序列,设计合成一对特异性引物,应用RT-PCR方法扩增出PRRSV的ORF6基因(M基因)。将所扩增片段克隆入原核表达载体pET-32a(+),pET-ORF6重组质粒转化DH5a宿主菌后,经双酶切、PCR鉴定后挑选阳性克隆测序鉴定并对插入的ORF6基因序列进行分析。结果表明,ORF6基因的原核表达载体构建成功。ORF6基因推导的氨基酸与美洲型相应基因的同源性为96.0%～100%,与LV株的同源性为79.9%,系统进化树表明该PRRSV属于美洲型。将构建成功的重组质粒pET-ORF6转化BL21,诱导后经SDS-PAGE和Western-blot分析表明:克隆在HIS标签的膜基质蛋白基因与HIS获得了高效表达,表达的融合蛋白HIS-M分子量约为39kDa,并且有免疫学反应活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的遗传变异分析

从GenBank中随机选取25株猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的全基因序列进行同源性分析并构建了基因进化树,同时对PRRSV ORF7基因序列进行遗传变异分析,发现PRRSV美洲株之间或欧洲株之间的ORF7基因相对保守,但美洲株和欧洲株的ORF7基因的核苷酸及氨基酸同源性较低.说明建立的针对N蛋白的多种检测方法在高致病性PRRSV肆虐的现今仍具有实用性.     

PRRSV辽宁株N蛋白基因的克隆及序列分析

以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)发病猪病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因全长cDNA,结果表明,该分离株N基因cDNA编码区长372bp,可编码123个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332、欧洲型代表株LV进行同源性比较,核苷酸同源性分别为92.2%和27.2%,推测该辽宁分离株属于美洲型。     

杂交野猪猪繁殖与呼吸综合征病毒分离及其ORF6、ORF7基因的序列分析

试验旨在研究杂交野猪猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) 辽宁分离株的遗传变异情况及分子生物学特征.用Marc-145细胞从辽宁某杂交野猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)病猪血液中分离到1株病毒,该分离毒株经Marc-145细胞6次传代后出现稳定的细胞病变,采用RT-PCR方法对分离病毒进行ORF6和ORF7基因的扩增、克隆和测序,并与已知序列毒株的相应片段进行同源性比对.结果表明,分离毒株的ORF6、ORF7基因与国内外美洲型毒株的核苷酸同源性分别为96.0%～100.0%、94.5%～99.4%;氨基酸同源性分别为89.6%～100.0%、87.3%～98.7%;与欧洲型代表毒株LV的ORF6、ORF7基因差异较大,核苷酸同源性分别为70.4%、70.1%,氨基酸同源性分别为48.8%、49.7%.推测辽宁杂交野猪体内分离毒株在基因型上属于美洲型毒株.     

2014年-2016年广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2和ORF5基因的遗传多样性分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传进化情况,对2014年-2016年来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2和ORF5基因的扩增和测序分析.结果获得34个Nsp2基因序列和45个ORF5基因序列,均属于美洲型毒株.Nsp2基因间核苷酸序列的同源性为91.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为81.3％~84.3％、88.9％~92.1％、94.3％~99.3％和73.5％~75.1％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为51.5％~53.2％.ORF5基因间核苷酸序列的同源性为82.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为83.7％~99.5％、85％~95％、83.8％~99.7％和83.2％~86.4％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为62.4％~64.5％.基于Nsp2和ORF5基因推导的氨基酸序列绘制的遗传进化树中,广西地区的毒株主要分布在以JXA1为代表的Ⅳ亚群.表明当前广西PRRSV流行毒株以JXA1株为代表的高致病性美洲型毒株为主,各毒株Nsp2和ORF5基因序列存在一定的差异,尚未发现欧洲型毒株和美洲型NADC30类毒株.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒辽宁分离株ORF5基因的克隆与序列分析

本试验以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)发病猪病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的ORF5基因全长cDNA,结果该分离株ORF5基因编码区长603bp,可编码200个氨基酸。与美洲型代表株VR2332、欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为89.5%和55.7%。推测该辽宁分离株属于美洲型。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒河南分离株ORF3～7基因克隆与序列分析

参照GenBank中公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）美洲株ATCC VR2332的ORF3～7基因序列,利用Pri mer软件分别设计合成了针对PRRSV ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7基因的特异性引物,利用RT-PCR从河南分离株Hn-1/06株分别扩增得到了大小约964、675、718、566和501 bp的片段,并将扩增的片段插入PGEM-T-easy载体进行测序。利用DNAStar软件进行序列分析表明,河南分离株Hn-1/06株属于美洲型,同时将Hn-1/06株ORF3～7基因的核苷酸序列和推导氨基酸序列与ATCC VR2332、LV、Resp、CH-1a、BJ-4、S1、CC-1、HB-1、JX0612、HUB1等分离株进行了同源性分析。     

福建地区猪繁殖与呼吸综合征ORF7基因遗传变异分析

为了解福建地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律,收集了福建省不同地区的12株PRRSV,并对其ORF7基因进行遗传变异分析。结果表明,福建地区存在欧洲型PRRS和美洲型PRRS,10株为美洲型PRRSV,与VR-2332、JXA1等美洲型参考毒株的氨基酸的同源性为89.5%~100%,与欧洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分别为59.5%~63.6%。而FJ-11、FJ-12 2株分离株为欧洲型PRRSV,与欧洲代表毒株LV的氨基酸的同源性分别为91.4%、92.2%,而与VR-2332、CH-1a等美洲参考毒株的氨基酸的同源性为60.3%~64.5%。美洲型PRRSV ORF7编码N蛋白氨基酸虽然发生了变异,但相对保守。     

PRRSV河南地方分离株ORF 2～6基因的克隆与序列分析

根据GenBank公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ATCC VR-2332株的ORF2-6基因的核苷酸序列,设计合成4对特异性引物,用RT-PCR方法扩增出PRRSV河南地方株(命名为HN-2株)的ORF 2～6片段,克隆到pUC-57T栽体并进行测序.应用DNAStar序列分析软件对分离株的ORF 2～6基因和其推导的氨基酸序列与不同来源的9个PRRSV毒株进行了同源性比较,结果表明:该分离株的ORF 2～6基因与不同来源美洲型毒株之间的同源性分别为89.1%～98.1%和81.4%～96.1%,而与欧洲型毒株之间的同源性仅为46.9%～61.9%和44.2%～45.0%;同时将分离株ORF 2～6基因的推导氨基酸序列与7个美洲型PRRSV毒株进行变异分析比较,证实了该分离株ORF 2-6基因发生了变异.     

两株高致病性PRRSV ORF6和ORF7基因克隆及序列分析

应用RT PCR方法从实验室分离的两株高致病性PRRSV SX、ZQ株中扩增出ORF6和ORF7,将其分别克隆、测序。用DNAStar 软件分析所测序列,并与VR 2332株、LV株、周边国家及国内分离株进行核苷酸和推导氨基酸同源性比较,并绘制系统进化树,结果ORF6、ORF7核苷酸与北美洲型的同源性为91.1％～100％,与欧洲型的同源性为66.2％～70.7％,推导氨基酸与北美洲型的同源性为91.2％～100％,与欧洲型的同源性为62.3％～82.3％。证明新分离到的PRRSV SX株、ZQ株仍属北美洲型。SX株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99.8%、100%;ZQ株ORF6、ORF7核苷酸与国内新分离到的高致病性PRRSV JXA1株同源性分别为99.6%、99.7%。     

PRRSV SD-1株ORF7基因的克隆、测序及原核表达载体的构建

参照PRRSV ATCC VR2332株基因序列设计1对引物P1、P2,经RT-PCR扩增出PRRSV SD-1株ORF7基因,经与PMD18-T Vector连接后筛选出阳性克隆株测序。把PRRSV SD-1株ORF7 cDNA亚克隆到PQE上构建PQE-N原核重组表达载体。结果表明,PRRSV SD-1株ORF7核甘酸序列与PRRSV ATCC VR2332株ORF7核甘酸序列完全一致,与欧洲株LV符合率为58%。成功构建原核表达载体PQE-N,为N蛋白的研究和制备诊断性抗原奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒TS株结构蛋白基因的克隆与变异分析

从河北唐山分离到一株疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV),接种Marc-145细胞,经2代盲传后出现细胞病变,经鉴定为PRRSV,命名为TS株。利用RT-PCR扩增出TS株各基因的cDNA片段,然后克隆入pMD19-T载体并测序。应用DNAStar软件,结合其它河北毒株与多株GenBank中已发表的PRRSV毒株相应基因进行序列比较。结果表明:PRRSV TS株与VR-2332同源性为88.9%-94.7%,与河北省2007年以来发现的8个毒株同源性很强,为98.0%-99.7%;与LV株的亲缘关系较远,同源性为61.2%-69.0%,属于美洲型。遗传进化树表明国内美洲型分离株明显分为2个亚群,所有河北省流行毒株属于同一亚群,且TS株与高致病性代表毒株JXA1关系非常近。本研究将为河北省预防和控制PRRS提供重要的理论数据。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒山西分离株ORF5基因的序列分析

采用RT-PCR方法对2009—2011年山西省疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)阳性病料进行克隆和测序,获得5个ORF5基因片段,并对其基因序列和推导的氨基酸序列与国内外毒株进行了同源性分析。序列分析结果表明,5个ORF5基因序列之间核苷酸同源性为97.7%～98.5%,与欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR-2332、2006—2007年国内分离的PRRSV变异株(JXA1、HuN、HUN4、HUB1)、2006年以前中国分离毒株(CH-1a、HB-1(sh)、HB-2(sh))和2个疫苗株(Resp PRRS MLV、MLV RespPRRS/Repro)核苷酸同源性分别为63.5%～64.0%、88.7%～89.2%、97.7%～99.3%、88.1%～96.7%和88.6%～89.1%;氨基酸同源性分别为56.1%～56.6%、87.8%～88.8%、96.6%～98.5%、85.9%～93.2%、86.8%～87.9%。结果表明山西地区的PRRSV流行毒株均属于美洲型,且毒株同源性很高,亲缘关系紧密。     

PRRSV云南A06株ORF5和ORF7基因的克隆与序列分析

设计2对引物分别扩增PRRSV的ORF5和ORF7基因,对从云南某猪场分离到的毒株A06进行RT-PCR检测,得到2条特异性扩增带,克隆至pMD18-T载体并测序。将A06株的ORF5和ORF7基因及其推断氨基酸序列分别与PRRSV欧洲型代表株LV、美洲型代表株VR2332和7株中国分离的美洲型毒株相应基因进行核苷酸和氨基酸序列比对分析。结果显示,A06株属于美洲型,其ORF5和ORF7基因及推断氨基酸与我国2006年分离的4株HP-PRRSV代表株的相似性高达98%～99%,与欧洲型代表株LV的相似性只有56%～64%。分别构建了以上毒株ORF5和ORF7基因的亲缘关系图谱,反映了A06株ORF5和ORF7基因的进化位置,完成2个基因的遗传变异分析。     

PRRSV NC株ORF3基因的克隆、序列分析及表达

为原核表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的ORF3基因,本研究根据GenBank登录PRRSV美洲株ATCC VR2332的ORF3基因序列,利用Primer 6.0软件设计合成一对特异性引物,经RT-PCR扩增得到了大小为765bp的片段。将扩增的ORF3基因截短为495bp和750bp片段分别克隆于原核表达载体pGEX-KG中,在IPTG的诱导下进行Gp3重组蛋白的截短表达,经western blot检测证实表达的2种截短重组蛋白均具有良好的与抗体的反应活性,从而为进一步研制新型疫苗提供了实验依据。