FnBPA-A遗传多态性对牛源金黄色葡萄球菌与牛乳腺上皮细胞相互作用的影响

为研究FnBPA-A不同遗传多态性重组质粒抗血清对牛源金黄色葡萄球菌与牛原代乳腺上皮细胞粘附作用的影响。采集奶牛乳腺组织样品,用组织块种植法和胰酶消化法进行纯化和传代培养,并利用对乳腺上皮细胞特异性角蛋白18进行鉴定。将4株不同金黄色葡萄球菌分离株作用于纯化的乳腺上皮细胞,分析不同菌株粘附牛乳腺上皮细胞的能力。进而比较研究FnBPA-A不同遗传多态性重组质粒免疫后的抗血清对4株不同金黄色葡萄球菌分离株与牛乳腺上皮细胞粘附的抑制作用。结果表明,分离纯化获得了牛原代乳腺上皮细胞,分析了该乳腺上皮细胞的培养特性,不同金黄色葡萄球菌分离株对该细胞粘附的检测结果表明,4株不同分离株粘附牛乳腺上皮细胞的能力明显不同(P0.05),其中GY278菌株粘附乳腺细胞的能力最强。FnBPA-A不同遗传多态重组质粒免疫后的抗血清抑制不同菌株粘附牛乳腺上皮细胞的能力也表现出明显的差异性,pV-819、pV-309、pV-20-2免疫组的抗血清对4株牛源金黄色葡萄球菌分离株的抑制作用高于其他免疫组。     

牛乳腺上皮细胞的分离培养

比较了几种乳腺细胞分离培养方法的特点。实验证明：胶原酶消化法和组织块种植法均可用于培养牛原代乳腺细胞。其中,胶原酶消化法容易得到均匀的乳腺细胞,且上皮细胞所占比例也比较高;组织块培养法不容易丢失、损伤上皮细胞,但上皮细胞长出较晚,且占比例较低,然而,用于培养小动物乳腺组织具有优势,并且可结合组织块转移、胰蛋白酶消化纯化上皮细胞,用此方法本实验获得了牛乳腺上皮细胞富集的细胞系;同时讨论了乳腺上皮细胞增殖与分化的关系,提出终末分化的腺上皮细胞已不再分裂增殖的观点。     

金黄色葡萄球菌诱导牛原代乳腺上皮细胞的凋亡

【目的】观察金黄色葡萄球菌能否诱导牛原代乳腺上皮细胞发生凋亡。【方法】先以新鲜牛奶为材料分离培养牛乳腺上皮细胞并鉴定,然后用金黄色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮细胞,采用普通光镜和扫描电子显微镜观察金黄色葡萄球菌诱导牛乳腺上皮细胞凋亡的形态学变化;用流式细胞仪（Annexin V/PI双染法）定量检测金黄色葡萄球菌感染对牛乳腺上皮细胞凋亡的诱导作用;RT-PCR检测细胞凋亡通路中关键蛋白caspase 3和caspase 8的变化情况。【结果】从乳汁中分离的细胞经原代培养后,细胞呈典型的铺路石状,细胞表层可产生大小不等的乳滴,RT-PCR法扩增出乳腺上皮细胞的骨架蛋白8特异性条带;免疫荧光细胞染色法结果显示分离培养的牛乳腺上皮细胞表达角蛋白8;金黄色葡萄球菌感染牛乳腺上皮细胞3 h后,可诱导牛乳腺上皮细胞发生凋亡,表现为细胞核皱缩,染色质边缘化和细胞浆内空泡增多等典型凋亡特征;Annexin V/PI双染法检测后发现,与对照组相比,感染组细胞凋亡率明显升高,差异极显著（P﹤0.01）;与对照组相比,感染组细胞caspase3及caspase 8表达量明显增高。【结论】金黄色葡萄球菌可以诱导牛原代乳腺上皮细胞凋亡,具有细胞凋亡的典型形态特征和生化特性,凋亡通路可能涉及caspase 3和caspase 8参与的外源性凋亡途径。     

猪子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞的分离培养

为了获得高纯度的猪子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞,对猪子宫内膜进行胶原酶消化,分离基质细胞和腺上皮细胞进行体外培养,研究其生长特性.结果表明:猪子宫内膜组织在37℃、通过1 g/L胶原酶Ⅰ消化90 min可以获得游离的腺体,对腺体进行培养时上皮细胞比例可达70％以上.培养过程中采用差速消化和差速贴壁可以成功分离腺上皮细胞和基质细胞.基质细胞最适贴壁时间为25 min,腺上皮为3h.纯化的基质细胞生长迅速,可传5代以上,上皮细胞生长缓慢,并且成片脱落.     

牛乳腺上皮细胞研究进展

主要介绍了牛乳腺上皮细胞培养方法、所建细胞系的研究进展,以及激素等调节因子和细胞外基质对乳腺上皮细胞分化及增殖的调控。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

【目的】探索一种简单且高效的原代奶牛乳腺上皮细胞的培养方法。【方法】采用组织块培养法、酶消化法培养奶牛乳腺上皮细胞;通过MTT法检测吸光度绘制细胞生长曲线;通过免疫组化法鉴定角蛋白-18的表达。【结果】酶消化法相比组织块培养法获得的细胞具有耗时短,获得量高等优点,MTT法绘制的生长曲线符合一般生物学特性,呈"S"型,奶牛乳腺上皮细胞中角蛋白-18阳性表达。【结论】酶消化法是一种简单且高效的培养原代奶牛乳腺上皮细胞的方法。     

麦洼牦牛乳腺上皮细胞系的建立及其生物学特性

为建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞的体外培养方法,采用组织块贴壁法及Ⅰ型胶原酶消化法,从麦洼牦牛乳腺组织中成功分离并获得纯化的乳腺上皮细胞,并利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力等生物学特性的检测,建立并鉴定麦洼牦牛乳腺上皮细胞系。结果显示,乳腺细胞形态良好,细胞接种存活率达91%,群体倍增时间26.97h,细胞生长曲线呈典型"S"型,细胞传至25代以上仍保持旺盛的增殖活力。可见,通过对细胞传代及反复冻存和复苏已成功建立麦洼牦牛乳腺上皮细胞系,获得大量的乳腺上皮细胞,使麦洼牦牛物种在细胞水平上得以保存,为建立牦牛乳腺生物反应器及泌乳调控机制研究提供基础。     

奶山羊乳腺上皮细胞系的建立

乳腺上皮细胞系的建立为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺表达载体的检测提供有利条件。本研究建立了正常培养的奶山羊乳腺上皮细胞系。利用胶原酶和透明质酸消化法从奶山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力检测等生物学性状的检测建立并鉴定了奶山羊乳腺上皮细胞系。结果表明,奶山羊乳腺上皮细胞在添加表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、转铁蛋白-硒钠、10%胎牛血清的DF12培养液中生长状态良好,细胞传至30代时仍保持旺盛的增殖活力。通过细胞传代及反复冻存和复苏实现了细胞系的长期保存,建立了乳腺上皮细胞系,获得了大量的乳腺上皮细胞。从而为开展奶山羊、奶牛等产奶动物乳腺生物反应器及泌乳机制的研究提供了便利条件。     

消化法培养山羊乳腺上皮细胞

为了寻找更加有效的山羊乳腺上皮细胞分离纯化方法。用2 g/L胶原酶和0.5 g/L胰蛋白酶相结合的消化法培养山羊乳腺上皮细胞,2~3 d细胞铺满单层,形态如铺路石。所得细胞再经0.5 g/L胰蛋白酶/0.2 g/L EDTA纯化3~4次,得到比较纯净的山羊乳腺上皮细胞。细胞鉴定结果表明,所得到的细胞角蛋白染色呈阳性,阳性率大于90%,波形蛋白染色呈阴性,具有典型的上皮细胞特性。消化法适用于山羊乳腺上皮细胞的体外培养。     

水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞的分离·培养和生物学特性研究

[目的]建立一种高效的水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞分离培养方法,为胚胎着床和子宫内膜相关疾病的分子生物学机制研究奠定基础。[方法]采用酶消化、刮取、系列过滤和差速贴壁相结合的方法分离水牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞,用免疫细胞化学法和台盼兰染色法检测分离细胞的纯度和活率。[结果]成功分离培养出子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞;免疫荧光染色和细胞计数表明上皮细胞和基质细胞的纯度均达90％以上;台盼兰染色结果显示,上皮细胞的活率为91％,基质细胞的活率为78％。[结论]采用酶消化、刮取、过滤和差速贴壁相结合的方法可分离出高纯度的永牛子宫内膜腺上皮细胞和基质细胞。     

小鼠乳腺上皮细胞的体外培养

采用I型、II型胶原酶和胰蛋白酶混合（1：1：1）消化乳腺组织,并用差速贴壁法纯化培养乳腺上皮细胞,倒置显微镜下观察细胞的形态,并用角蛋白18免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定。结果表明：改良型混合酶消化法能获得较多的细胞团,且12h后细胞团绝大多数已贴在细胞瓶壁,72h后细胞团完全铺开呈单层融合,细胞呈典型的铺路石样。免疫荧光鉴定结果显示,角蛋白18呈阳性反应。因此,应用改良型混合酶消化法能在短时间内获得大量较纯的乳腺上皮细胞。     

转甜味蛋白Brazzein基因乳腺特异表达载体的山羊体细胞株筛选

[目的]建立通过山羊乳汁获取甜味蛋白Brazzein的方法.[方法]将前期工作中构建的Brazzein基因山羊乳腺特异表达载体STP-pBC1进行线性化,采用脂质体法转染山羊成纤维细胞,以期获得转基因阳性细胞.[结果]采用脂质体法转染山羊成纤维细胞后,通过最适G418浓度（400 μg/ml）筛选获得转基因阳性细胞;转基因阳性细胞形态呈现梭形且核仁清晰,其生长曲线呈现正常的“S”;转基因阳性细胞经冷冻复苏后,仍呈现与冷冻前新鲜转基因细胞相似的形态和生长曲线;PCR鉴定结果表明,STP-pBC1已整合入转基因细胞的基因组中.[结论]成功获得乳腺特异的转甜味蛋白基因Brazzein的山羊成纤维细胞株.     

小鼠乳腺中瘦素的信号转导通路

为研究小鼠乳腺发育、泌乳和退化过程中瘦素的信号转导通路,分别取妊娠12d、泌乳12d以及退化12d小鼠乳腺组织进行体外培养,对照组培养基为无血清培养基,处理组培养基中则只添加瘦素。培养48 h后取出分别提取乳腺上皮细胞总蛋白,并用免疫印迹的方法检测对照组和处理组乳腺上皮细胞中信号分子MAPK、STAT3和STAT5的磷酸化情况。结果表明,虽然在妊娠期、泌乳期和退化期乳腺上皮细胞中均有MAPK、STAT3和STAT5信号分子存在,但是在妊娠期瘦素只能专一性的诱导MAPK磷酸化,泌乳期瘦素可以激活STAT3和STAT5,而在退化期瘦素则特异性地激活STAT3,启动乳腺上皮细胞的凋亡过程。     

羊乳腺上皮细胞的形态观察

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物,并根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化。对细胞形态进行光镜观察发现:纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;部分细胞呈长形。纯化的乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体。     

组织块种植法体外培养奶牛乳腺上皮细胞

为建立成熟的奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系,以组织块种植法培养荷斯坦泌乳期成年母牛乳腺组织,观测长出的上皮细胞在各生长时期的形态变化,绘制生长曲线并计算群体倍增时间,用免疫组化技术鉴定乳腺上皮细胞角蛋白18的表达,用SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析技术检测乳腺细胞的酪蛋白分泌情况。试验结果表明,此培养体系可获得良好的奶牛乳腺上皮细胞,原代以及传代培养,细胞增殖旺盛,长势良好;细胞骨架蛋白——角蛋白18表达为阳性,且培养的细胞具有分泌牛乳酪蛋白的功能。     

奶牛乳腺上皮细胞的原代培养

1材料与方法 1．1材料 1．1．1乳腺组织。从屠宰场选取健康的泌乳期奶牛,无菌手术切取乳腺实质组织,置于DMEM／F12完全培养液（含10％胎牛血清、100IU／ml青霉素和链霉素）中,尽快运回实验室。     

Regulation of leptin in involution of mammary gland

Leptin,a protein hormone produced and secreted predominantly by white adipose tissue,has a critical role in the regulation and coordination of energy metabolism.Leptin is produced in the mammary gland by the fat tissue or by the mammary epithelium.In vitro study has shown that leptin triggers apoptosis in mammary epithelial cells.Mammary gland involution is characterized by extensive apoptosis of the epithelial cells.At the onset of involution,STAT3 is specifically activated.Various studies show that leptin act as a paracrine and autocrin factor to influence mammary epithelial cell proliferation and differentiation.This paper reviewed the function of leptin to the involution of mammary gland.     

高温条件下miRNA-24对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响

【目的】MicroRNA(miRNA)是一类长度约21-23个核苷酸的非编码小RNA分子,本研究旨在分析高温条件下miRNA-24对乳腺上皮细胞生长、凋亡的作用及其初步机制。【方法】体外培养奶牛乳腺上皮细胞,高温(41℃)处理所培养的细胞;应用miRNA基因沉默技术,抑制高温处理过的乳腺上皮细胞中miRNA-24的表达;采用细胞计数法分析细胞增殖情况;Hoechst33342/PI荧光染色、流式细胞术检测miRNA-24对乳腺上皮细胞凋亡的作用,Western blot检测凋亡相关因子表达变化。【结果】抑制miRNA-24的表达,高温条件下的乳腺上皮细胞增殖能力显著增强(P0.05),凋亡细胞数显著减少(P0.05),促凋亡因子caspases-8和caspases-3表达量下调。【结论】内源性miRNA-24对乳腺组织发育具有重要的调控作用,抑制miRNA-24的表达可以缓解高温诱导下奶牛乳腺上皮细胞凋亡发生率、促进细胞的生长发育。