兔出血症病毒VP60蛋白真核表达及其免疫原性研究

将兔出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因,克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建pcDNA-VP60,并将其转染Vero细胞.间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测pcDNA-VP60在细胞中的表达情况,同时将pcDNA-VP60免疫实验兔,观察血清中特异性抗体变化情况.试验结果表明,本文构建的pcDNA-VP60不仅能在Vero细胞中表达VP60蛋白,而且能够诱导机体产生免疫应答.     

The construction of the rabbit hemorrhagic disease vires VP60 gene in the eukaryotic expression vector and its expression in eukaryotic

应用RT—PCR技术扩增编码兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因,将PCR产物克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）中,获得重组质粒pcDNA-VP60,并将其转染Vero细胞。经间接免疫荧光试验,证实pcDNA-VP60在体外细胞中能够成功表达具有免疫原性的VP60蛋白。     

VP22与EGFP、3种弓形虫抗原融合表达重组质粒的构建与鉴定

为了探索新型弓形虫疫苗的传递系统,本试验分别构建了细胞渗透肽VP22与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达的重组质粒（pcDNA-VP22-EGFP）,以及细胞渗透肽VP22与3种弓形虫抗原融合表达的重组质粒（pcDNA-VP22-SAG1、pcDNA-VP22-GRA4、pcDNA-VP22-AMA1）。经PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定后,将重组质粒pcDNA-VP22-EGFP转染COS7细胞,通过荧光显微镜和RT-PCR检测,验证VP22-EGFP基因在COS7细胞中的表达情况。PCR鉴定、酶切鉴定和序列测定结果显示所有重组质粒均构建正确。转染72 h后的细胞,在荧光显微镜下成功观察到绿色荧光。RT-PCR扩增得到了大小为1 449 bp的目的条带,与预期结果一致。结果表明,重组质粒构建成功。     

鹅细小病毒YBLJ株VP3基因的真核表达

为了研究鹅细小病毒(GPV)YBLJ株VP3基因的生物学特性,根据已克隆的GPV YBH株VP3基因序列(GenBank:JN836326),设计并合成一对特异性引物,经PCR扩增、克隆、转化、酶切与亚克隆,构建真核表达载体pcDNA-VP3,将鉴定正确的质粒转染至Vero细胞,经RT-PCR检测VP3基因转录水平,通过间接免疫荧光试验(IFA)观察VP3基因表达水平.结果显示,克隆的VP3基因全长约1 605 bp;构建了真核表达载体pcDNA-VP3,经RT-PCR对转染细胞总RNA扩增得到特异性目的片段,IFA检测显示VP3基因在Vero细胞中获得了稳定表达.本研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础.     

传染性法氏囊病病毒VP2与C3d串联基因重组表达质粒的构建及其免疫功能研究

为提高传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因核酸疫苗的免疫效力,本研究根据已发表的鸡源补体C3d序列,设计并合成在5’端添加编码连接肽(Gly4Ser)2序列的C3d基因。用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ构建含有3拷贝C3d与VP2基因融合的重组表达质粒pcDNA-VP2-3C3d。用脂质体法转染BHK21细胞,48 h后,westernblot分析表明,表达的重组蛋白为162 ku;间接免疫荧光试验检测转染细胞中具有特异性荧光。用pcDNA-VP2-3C3d与前期构建的pcDNA-VP2分别免疫2周龄SPF鸡,二免14 d后,间接ELISA法检测IBDV抗体效价,pcDNA-VP2-3C3d组抗体水平显著高于pcDNA-VP2组;MTT法检测鸡脾淋巴细胞增殖活性,pcDNA-VP2-3C3d组免疫诱导的特异性淋巴细胞增殖活性显著高于pcDNA-VP2组(p<0.05)。本研究表明C3d可以增强VP2基因免疫诱导的IBDV特异性体液和细胞免疫应答。     

猪细小病毒VP2基因核酸疫苗的构建及免疫原性

将PPV VP2基因酶切后克隆到真核表达载体pcDNA-3.1(+)中,构建pcDNA-VP2,经脂质体法转染IBRS-2细胞后,Western blotting检测pcDNA-VP2能正常表达.采用 pcDNA-VP2肌注Balb/c小鼠,作间接ELISA抗体检测试验,并采用淋巴细胞增殖试验(MTT法)和流式细胞仪(FACS)法对小鼠的细胞免疫进行检测.结果表明,pcDNA-VP2能诱导小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答.PCR扩增检测结果显示,未能从免疫小鼠各组织的基因组中扩增出VP2基因片段.     

兔出血症病毒衣壳蛋白N端携带双串联卵清蛋白T细胞表位嵌合体的构建与表达

在兔出血症病毒(RHDV)主要结构蛋白VP60的N端插入双串联卵清蛋白(OVA)CD8+T细胞表位(OVA第257-264位氨基酸),研究外源片段对VP60蛋白表达及病毒样颗粒(VLPs)装配的影响,分析VP60作为载体的可行性和对外源基因长度的耐受性。通过分子生物学方法将双串联OVA CD8+T细胞表位(257-264aa)插入至RHDV衣壳蛋白VP60基因序列的N端,得到重组VP60基因。利用杆状病毒表达系统表达嵌合蛋白,并命名为DN。经RT-PCR、间接免疫荧光、SDS-PAGE、Western blot方法鉴定嵌合蛋白DN的表达,利用电镜观察嵌合蛋白病毒样颗粒的形成。结果表明嵌合VP60蛋白在杆状病毒表达系统中得到高效表达,且可形成与RHDV VLPs类似的病毒样颗粒。本研究为VP60作为载体系统,有效提呈外源片段的研究提供了重要依据,同时也为VLPs疫苗的研制奠定了基础。     

鸡贫血病毒VP3基因的克隆及诱导人肺癌A549细胞凋亡的研究

为了观察鸡贫血病毒VP3基因在人肺癌A549细胞中的凋亡诱导情况,试验用PCR方法扩增了鸡贫血病毒的VP3基因,并将其克隆于真核表达载体pcDNA3.1上,构建含VP3基因的重组体,在体外利用LipofectamineTM2000介导的基因转染法将pcDNA-VP3转入人肺癌A549细胞中,用RT-PCR法检测VP3基因在细胞中的表达状况,同时利用流式细胞术检测验证VP3基因诱导凋亡的方式.结果表明:试验获得了VP3基因正确插入的真核表达载体;转染后VP3基因在细胞中得到了表达;鸡贫血病毒的VP3基因确以凋亡的方式诱导了肺癌细胞A549凋亡.     

口蹄疫病毒VP2基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

本试验旨在构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因重组表达载体,并建立稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系。利用RT-PCR方法扩增Asia 1型FMDV的cDNA,获得VP2基因完整的编码区,构建可表达VP2的带有绿色荧光蛋白标记基因的pIRES2-EGFP-VP2重组表达载体。经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染293T细胞,通过Western Blot技术检测VP2蛋白的瞬时表达;然后再转染BHK-21细胞,通过G418筛选,形成单克隆细胞系,经荧光筛选到表达EGFP的抗性单克隆细胞,扩繁培养克隆细胞,再通过West-ern Blot技术检测其VP2的表达,最终筛选到稳定表达FMDVVP2基因的BHK-21细胞系。结果表明,VP2基因重组表达载体pIRES2-EGFP-VP2构建正确,能够在293T细胞内瞬时表达;转染BHK-21细胞,经G418筛选到表达VP2基因的BHK-21细胞克隆,经长达60d的传代,获得了稳定表达VP2基因和EGFP的BHK-21细胞系。上述结果表明,我们建立了稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系,为进一步探讨VP2基因在FMD...     

鸡传染性贫血病毒VP1、VP2基因的表达及免疫原性研究

为探索鸡传染性贫血重组蛋白亚单位疫苗的可行性,将鸡传染性贫血病毒基因分别克隆到转移载体p Fast Bac HTA中,再将其分别转化DH10Bac感受态细胞得到相应的重组表达载体,转染昆虫细胞Sf21获得含有VP1、VP2基因的重组杆状病毒v Bac-VP1、v Bac-VP2,应用悬浮培养的Sf21细胞表达重组蛋白。SDS-PAGE及Western blotting结果证明,VP1、VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,动物试验进一步证实,重组蛋白免疫SPF鸡可产生ELISA抗体,提示杆状病毒表达的VP1、VP2具有良好的免疫原性。     

牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶真核表达载体的构建及在Hela细胞中的表达

为了研究牛结核分枝杆菌溶血磷脂酶基因(Lip)的生物学特性及其功能,试验构建了Lip-pEGFP融合基因的真核表达载体,利用脂质体(lipofectamine2000)将其转染到Hela细胞中,用荧光显微镜检测GFP在细胞中的表达情况。结果显示,重组Lip-pEGFP载体在Hela细胞中获得了高效表达,且能够稳定传代,为进一步研究Lip的生物学功能及其在牛结核分枝杆菌中的作用奠定了基础。     

犬新孢子虫SRS9基因真核重组质粒的构建及在Vero细胞中表达

为构建犬新孢子虫NcSRS9基因真核表达重组质粒,了解NcSRS9表面蛋白基因的生物学特性及其体外表达情况。本试验应用PCR技术获得目片段,构建克隆质粒pMD18-NcSRS9,经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后构建真核表达重组质粒pVAX1-NcSRS9,利用脂质体介导法转染至Vero细胞,以间接免疫荧光方法(IFAT)检测NcSRS9基因在Vero细胞中的表达。结果显示,犬新孢子虫表面蛋白基因NcSRS9基因长度为1 191bp,与GenBank中(EF440644.1)发表的基因核苷酸序列同源性为99%,IFAT检测NcSRS9基因在Vero细胞中获得瞬时表达,为核酸疫苗研究奠定了基础。     

白颖苔草热激转录因子（HSF1）真核表达载体的构建

摘要：根据表达载体PBI 121特性及酶切位点设计合适的引物，由表达引物通过PCR技术从含有白颖苔草（Carex rigescens）CrHsf全长cDNA的克隆载体的大肠杆菌上扩增出带有特定酶切位点的CrHsf完整开放阅读框。再对载体和目的片段进行酶切处理，处理后将正确的目的基因片段亚克隆至PBI 121植物表达载体。通过PCR及酶切鉴定，结果证明，目的基因片段已被正确克隆到表达载体上，载体构建成功。     

兔防御素cDNA表达质粒的构建及其表达

将兔防御素（MCP－1）cDNA插入真核表达载体pcDNA3的EcorRⅠ和XbaⅠ酶切位点之间，构建了兔MCP－1cDNA的真核表达质粒pcDEF。通过脂质体转染，使兔MCP－1 cDNA在COS－7细胞中表达，在转染60、84、108h后，提取总RNA。采用RT－PCR，在288bp的位置扩增出1条特异性带；RNA斑点印迹杂交表明，兔MCP－1 cDNA在60、84、108h均有表达。     

猪食欲肽受体2基因真核表达质粒的构建及其表达

构建带有myc标签和Kozak序列的猪食欲肽受体2(OX2R)基因的真核表达质粒pcDNA3.1(+)-myc/OX2R,观察在HEK293T真核细胞中的表达。设计带有酶切位点(HindⅢ和XbaⅠ)的特异性引物,采用RT-PCR技术从猪的下丘脑中扩增OX2R基因,并克隆入pcDNA3.1(+)质粒中。用限制性内切酶酶切分析及测序分析证明构建成功后,用脂质体法转染HEK293T细胞,蛋白质印迹法检测OX2R基因的表达。结果,成功构建了带有myc标签和Kozak序列的pcDNA3.1(+)-myc/OX2R重组质粒,蛋白质印迹法检测该质粒可在真核细胞中表达。本研究为将来研究猪食欲肽受体2的功能奠定基础。     

新孢子虫核糖体磷蛋白基因真核表达载体的构建及瞬时表达

采用PCR技术扩增出新孢子虫核糖体磷蛋白(NcP0)全长基因片段,并将其克隆入真核表达载体pVAX1中,构建pVAX1-NcP0表达载体。用脂质体法将阳性克隆瞬时转染Vero细胞,对转染细胞进行RT-PCR检测和IFA检测目的基因的转录与表达情况。结果表明克隆的P0蛋白基因序列全长为1 379 bp;RT-PCR结果显示目的基因已被成功转录;IFA检测证明目的基因被成功表达。本试验成功构建了NcP0的真核表达载体,转染Vero细胞,获得了NcP0的瞬时表达。     

猪γ-干扰素基因真核重组表达质粒的构建

用RT—PCR方法从长白猪脾脏淋巴细胞中扩增出猪γ-干扰素(IFN-γ)基因，经克隆测序表明与已发表序列同源性为100％。将目的基因插入表达载体pcDNA3．1( )，构建出真核重组表达载体IFN-γ-pcDNA。将重组质粒转染COS7细胞，检测转染细胞培养上清IFN-γ活性，结果表明转染上清对猪繁殖与呼吸综合征病毒有抑制作用。     

戊型肝炎病毒RdRp基因真核表达质粒的构建及表达

目的 构建戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV )RdRp基因真核表达质粒,并检测其在PLC/PRF/5、A549和HepG2 3种细胞中的表达,为后续RdRp的研究提供实验依据.方法 利用RT-nPCR法从阳性HEV粪便中扩增RdRp基因片段,插入pcDNA3.0真核表达载体中,并在其3’端插入EGFP报告基因,构建融合表达质粒pcDNA3.0-RdRp-EGFP,脂质体法转染PLC/PRF/5、A549和HepG2细胞,荧光显微镜观察报告基因的表达,RT-nPCR检测RdRp基因mRNA的转录情况,Western blot检测RdRp蛋白的表达.结果 重组表达质粒经酶切鉴定和测序证实构建正确;RdRp基因和蛋白在A549和HepG2细胞中可高效、特异性表达.结论 成功构建了RdRp基因对真核表达质粒,并在A549和HepG2培养细胞中大量表达,为进一步研究RdRp在HEV复制过程中的功能奠定了基础.     

牛肌肉生成抑制素基因真核表达载体的构建及其在COS-7细胞中的表达

将构建的牛pMD 18-T-MSTN克隆载体与真核表达载体pef-dhfr1a酶切,回收牛MSTN目的片段及pef-dhfr1a载体,构建了牛MSTN基因的真核表达质粒pef-dhfr1a-MSTN,然后转染COS-7细胞,将牛MSTN成熟蛋白编码序列在COS-7细胞中进行了表达.提取转染细胞的总RNA,采用RT-PCR和Western-blotting方法,分别从mRNA水平和蛋白质水平上检测到了牛MSTN基因在COS-7细胞中的表达产物,证明已经成功构建出该基因的真核表达载体.