牛生长激素基因工程茵的构建及其诱导表达

为获得牛生长激素（BST）蛋白，构建了工程菌并进行了诱导表达．先设计2对引物，从pUCm—T-BST克隆中扩增出BST成熟蛋白编码序列，双酶切后分别插入表达载体（pET30a和pET29a），转化E．coli DH5a并进行阳性克隆鉴定；再将重组质粒分别转化到E．coli BL21（DE3）和RosettaTM（DE3）pLysS中，构建BST原核工程菌；最后进行诱导表达．结果表明，重组表达载体pET30a—BST和pET29a—BST中均插入了正确的目的基因；经IPTG诱导后，以BL21（DE3）为宿主的工程菌无目的蛋白表达，而pET30a—BST／Rosetta^TM和pET29a．BST／Rosetta^TM分别可见分子量约29．5，26．5kD的融合蛋白表达，约占菌体蛋白的26％，35％．说明稀有密码子限制BST基因在E．coli中的表达。选择适宜的宿主菌可克服此障碍．     

巴西橡胶树K+通道蛋白HbKCO1的原核表达

K+通道蛋白在维持细胞离子平衡等生命活动中发挥重要的作用.利用真核或原核表达系统高效表达K+通道蛋白是深入研究其生化特征及生理功能的基础和前提.该研究在成功克隆巴西橡胶树Hevea brasiliensis)K+通道蛋白基因cDNA全长的基础上,将HbKC01 cDNA编码区插入pET-28a构建原核表达载体pET-28a(+)-HbKCO1,并分别转化大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS和BL21(DE3)菌株.经过条件优化,转化的大肠杆菌RosettaTM(DE3)pLysS菌株经1mM IPTG诱导3h能够高效表达HbKCO1重组蛋白,但同等条件下转化的BL21(DE3)菌株仅能微量表达.HbKCO1重组蛋白原核表达具有菌株依赖性.     

水稻白叶枯病菌HrpF_(Xoo)与GFP的体外融合表达

从水稻白叶枯病菌中克隆hrpF基因,hrpF与gfp(Green fluorescent protein)基因融合,连接pET30a( )载体,构建重组质粒pET30a( )::hrpFXoo::gfp,转化宿主菌BL21 (DE3) 产生表达菌株pOFG.表达菌株经IPTG诱导培养,获得了HrpF的GFP融合蛋白.收集菌体通过超声波破碎后,分别取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳,可见116 300 大小的组氨酸标记的HrpF与GFP的融合蛋白条带,与分析软件推测大小一致.该研究结果将促进HrpF蛋白功能研究.     

斑马鱼p53基因原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

利用原核表达系统克隆表达斑马鱼p53基因。RT-PCR法从斑马鱼胚胎中扩增获得p53基因编码区,并将其克隆至原核表达载体pET28a上,构建重组质粒pET28a/z-p53,将重组质粒转化E.coli BL21(DE3)受体菌,IPTG诱导表达,表达产物经镍柱纯化、尿素透析复性,SDS-PAGE电泳分析,结果表明,p53基因在大肠杆菌中成功表达,表达的p53融合蛋白分子量大约为53kD,透析复性后获得了高纯度可溶性的p53蛋白。     

新疆南疆地区奶牛乳房链球菌gapC基因原核表达载体的构建

为获得乳房链球菌(Streptococcus uberis)gapC基因的原核表达载体,通过PCR方法扩增出新疆南疆地区奶牛乳房链球菌临床分离株的gapC基因,并克隆到原核表达载体pET32a(+)中,构建了重组质粒pET32a(+)-gapC,将重组质粒转化宿主菌E.coli BL21进行重组蛋白的表达。实验结果表明,IPTG诱导5～9 h均可获得大量重组蛋白。重组蛋白分子量约为54.0 kD,介于43 kD～66.2 kD之间,与预期大小一致,说明表达载体构建成功。通过优化最佳诱导条件,获得乳房链球菌gapC基因重组蛋白的最佳诱导条件为0.5 mmol/L IPTG诱导6 h即可获得大量重组蛋白,为进一步确定蛋白的免疫保护性和制备疫苗奠定了基础。     

CRP基因原核表达载体的构建和表达及其免疫原性检测

采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白。以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的CRP基因,将其克隆入表达载体pET28 a( )中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原性检测。成功地构建了CRP基因原核表达载体pET28 a( )-CRP,经IPTG诱导SDS-PAGE电泳分析表明C-反应蛋白能在大肠杆菌中获得表达,但免疫原性检测初步结果为阴性。结果证明CRP能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到大量表达,表达产物缺乏免疫原性,其机理还有待进一步试验探讨。     

丁香假单胞菌极毛蛋白hrpA基因的克隆与表达

将丁香假单胞菌番茄变种DC3000(P.syringae pv.tomato DC3000)极毛蛋白hrpA基因克隆到pET32a(+)载体上,获得重组表达载体pET32a(+)-hrpA.将重组质粒转入宿主E.coli BL21(DE3)溶源菌中,通过SDS-PAGE分析表明,在1.0mmol.L-1异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)的诱导下,重组子成功表达了分子质量约为28 ku的融合蛋白(目标蛋白基因与硫氧还蛋白基因的融合表达产物).并利用Ni2+-NTA柱亲和层析分离获得纯化的HrpA蛋白,质量浓度为91.8 g.L-1.     

猪瘟病毒E2基因的克隆表达

PCR扩增猪瘟病毒(CSFV)定点突变后的E2基因,克隆至原核表达载体质粒pET-28a中,重组质粒pET28a-E2转化BL21(DE3),IPTG诱导,高效表达了E2基因,表达量达菌体总蛋白的25.3%。免疫印迹表明,所表达的蛋白是CSFV特异性的。     

植物乳杆菌亚油酸异构酶基因在大肠杆菌中的表达和功能鉴定

应用基因重组表达技术将一个推定的植物乳杆菌亚油酸异构酶基因(pli18)克隆到pET-30a载体的T7启动子的下游,构建pET30-pli原核表达载体。经IPTG诱导和低温培养20h后,在其宿主菌E.coliBL21(DE3)中成功表达了可溶性的PLI18重组蛋白。通过Ni-NTA亲和层析纯化和酶反应产物的气相色谱检测表明,PLI18重组蛋白具有亚油酸异构酶活性,从而证明pli18基因为1个新的亚油酸异构酶基因。为亚油酸异构酶的进一步研究及其在农产品加工中的应用打下了基础。     

猪BMP4基因原核表达及优化

构建猪BMP4基因pET32a-BMP4原核表达质粒,在E.coli中表达并分离纯化目的蛋白。采用PCR技术以pMD18-T-BMP4重组质粒为模板扩增获得BMP4基因编码成熟肽片段,并插入到原核表达载体pET32a中,构建原核表达重组质粒pET32a-BMP4。将阳性重组质粒转化到表达宿主菌中,在不同的温度、IPTG浓度和时间下进行诱导表达,SDS-PAGE分析鉴定。构建的重组表达质粒经PCR、酶切和DNA测序鉴定与预期的结果一致,表达宿主菌经IPTG诱导表达分子量约为31 ku的融合蛋白,表达产物占菌体总蛋白的30%以上。成功构建了pET32a-BMP4原核表达质粒,并经纯化得到BMP4目的蛋白,为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定基础。     

中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶基因的原核表达

通过双酶切、连接转化等方法将中国水仙类黄酮-3-O-葡糖基转移酶(NT3GT)基因克隆到原核表达载体pET29a上,构建原核表达重组质粒pET29a-NT3GT。重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)后经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,NT3GT基因在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达,表达的融合蛋白分子量约为55kDa。成功构建其原核表达载体并使其在大肠杆菌中得到高效表达,为NT3GT抗血清的制备及功能分析奠定基础。     

外源重组蛋白制备鹅免疫球蛋白轻链特异性多克隆抗体

采用RT-PCR方法扩增鹅免疫球蛋白轻链恒定区编码序列(GoIgCL),构建原核表达载体pET30a-IgCL,在RosettaTM(DE3)pLysS宿主菌中表达鹅免疫球蛋白轻链恒定区重组蛋白rGoCL,以纯化后rGoCL作为免疫原制备兔抗GoIgL多克隆抗体,对多抗进行鉴定分析.结果表明,rGoCL在大肠杆菌中获得可溶性表达,可代替天然分离的轻链作为免疫原制备轻链特异性抗体,多抗效价为1 204800.研究为鹅免疫球蛋白的蛋白结构、功能分析以及鹅免疫诊断试剂研发奠定基础.     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达及多克隆抗体制备

【目的】构建兔出血症病毒衣壳蛋白VP60基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】以保存的VP60基因的质粒(pTeasy-VP60)为模版,用PCR方法获得VP60基因,并将其克隆到pET28a(+)载体上,构建重组表达载体pET28a(+)-VP60,酶切鉴定和测序验证后转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,优化诱导表达时间和IPTG浓度;利用镍离子螯合层析纯化重组蛋白,并制备了高效价的抗VP60多克隆抗体。【结果】成功构建了兔出血症病毒衣壳蛋白VP60的原核表达质粒pET28a(+)-VP60,其在大肠杆菌中以包涵体形式高效表达,重组蛋白分子质量为60 ku,制备的多克隆抗体具有较强的免疫结合活性。【结论】成功实现了VP60基因的原核表达,制备了重组蛋白VP60的多克隆抗体,为进一步的VP60转基因研究奠定了基础。     

捻转血矛线虫Hc38重组蛋白的表达纯化及抗原性鉴定

[目的]通过表达和纯化捻转血矛线虫新功能基因He38最大开放阅读框ORF1,确定完整的Hc38蛋白天然表达形式、分子量大小和免疫学活性鉴定,为研究该基因功能和基因工程应用奠定基础.[方法]参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的He38基因序列(AY594263)设计引物,PCR扩增目的基因并克隆到表达载体中,重组表达载体转化大肠杆菌后IPTG诱导表达,SDS-PAGE和薄层扫描检测分析表达产物,通过亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western bloting和ELISA方法检测其抗原性.[结果]Hc38基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白相对分子量约为68 KD,表达量占菌体蛋白总量的30;,亲和层析柱纯化出目的蛋白,并能被捻转血矛线虫病绵羊阳性血清和重组表达产物免疫小鼠血清识别,具有反应原性.[结论]实现了Hc38基因的原核表达和纯化,验证了Hc38基因在虫体内的表达形式和抗原性.     

人核糖体40S亚基RPS11蛋白的原核表达和纯化

RPS11是核糖体小亚基40S的组成部分,属于核糖体蛋白S17p家族,由RPS11基因所编码,主要存在于真核生物中。本研究通过PCR扩增RPS11基因,构建pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11原核表达载体。将重组质粒转入E.coli DH5α,序列测定正确后,将其转入E.coli BL21(DE3),加入IPTG诱导表达。表达蛋白经SDS-PAGE分析后,利用亲和层析法纯化蛋白。结果成功克隆RPS11基因,构建了原核表达载体pET43a-RPS11和pGEX-4T-1-RPS11,转化宿主菌E.coli BL21(DE3)中进行了表达。SDS-PAGE分析证实表达目的蛋白正确。通过Ni-TNA和GSH-Sepharose层析柱获得纯化蛋白,为进一步研究该蛋白的生物学功能奠定了基础。     

H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达

应用带有His6尾的pET原核表达系统对禽流感病毒血凝素蛋白进行表达,将禽流感A/Turkey/Wisconsin/66(HgN2)的HA基因克隆至原核表达载体pET-30a中,经酶切、PCR扩增和测序分析确证其插入,并且阅读框正确,获得重组质粒pET30a-H9.将此重组质粒转化到宿主菌BL21中,用诱导剂异丙基硫代...     

番茄黄化曲叶病毒CP基因的原核表达载体构建选择

[目的]筛选出目的蛋白能够高效表达的重组质粒。[方法]利用原核表达载体pET-32a(+)和pET-28a(+)成功构建了番茄黄化曲叶病毒(Tomato Yellow Leaf Curl Virus,TYLCV)外壳蛋白(Coat Protein,CP)基因的重组质粒p32a-CP和p28a-CP,并通过PCR和双酶切鉴定了序列连接的正确性;再分别将2个载体转化至BL21(DE3)中,采用不同浓度的IPTG对其进行诱导表达,并进行SDS-PAGE电泳检测。[结果]测序结果显示TYLCV-CP基因已定向插入p32a-CP和p28a-CP中;SDS-PAGE电泳结果显示分子量约为50 kD的目的蛋白在重组载体p32a-CP中得到了高效表达,而在重组载体p28a-CP中未表达。[结论]为下一步的抗体制备及TYLCV的免疫学检测奠定了基础。     

乌骨鸡Cathelicidins 类抗菌肽基因在大肠杆菌中的融合表达与抑菌活性

Cathelicidins抗菌肽是含高度保守cathelin结构域的一大类抗菌肽,在家禽天然免疫系统中发挥重要作用。通过PCR方法,从含乌骨鸡Cathelicidins抗菌肽基因（CathL\|1,\|2,\|3）cDNA完整序列的质粒pMD\|CathL中分别扩增Cathelicidins\|1,\|2,\|3成熟肽的编码序列,将其分别克隆至原核表达载体pET\|30a（+）中,构建其重组表达质粒pET30\|CathL1S,pET30\|CathL2S,pET30\|CathL3S,经测序验证的重组质粒转化大肠杆菌Rosetta（DE3）菌株。阳性克隆菌株在37℃,10 mmol·L-1 IPTG的条件下进行诱导表达。SDS\|PAGE和Western\|blot分析表明,Cathelicidins成熟肽片段均在大肠杆菌中以融合形式成功表达,表达产物的表观分子量分别为70,80,75 kD。琼脂糖孔穴扩散法检测显示表达产物对多种革兰氏阴性菌和阳性菌均具有很好的抑制活性,其对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、鸡白痢沙门氏菌C79\|13 （Salmonella pullorum）、巴氏杆菌、鸭疫里默氏杆菌、绿脓杆菌等供试菌株均有较强的抑制作用,尤其对抗生素耐药菌株有明显的抑制作用。     

猪源ETEC的黏附素基因克隆与原核表达

[目的]克服传统方法制备黏附素抗原的缺点。[方法]应用PCR对猪源性产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)的黏附素F4、F5和F6的质粒中扩增出faeG、fanC和fasG基因片段,克隆测序并与pET 32a(+)构建重组表达载体。将重组表达载体转化E.coli表达菌株BL21(DE3),并分析其免疫原性。[结果]重组表达载体经IPTG诱导获得高效表达。血凝抑制试验表明,鼠抗血清能抑制标准的ETEC强毒株凝集红细胞,抑制效价在1∶128以上。这说明克隆表达的猪源ETEC黏附素蛋白具有良好的免疫原性。[结论]该研究可为进一步开发抗体制剂奠定基础。     

拟南芥AtCOR15a抗寒基因原核表达载体的构建及蛋白表达

[目的]通过RT-PCR获得拟南芥AtCOR15a基因的ORF全长,经酶切、连接,以pET-28a(+)为原核表达载体.构建成pET28a-COR15a的重组表达载体,研究该基因在大肠杆菌中的表达情况,为进一步研究该基因的功能奠定基础.[方法]根据拟南芥AtCOR15a基因序列设计特异引物,利用RT-PCR的方法扩增目的基因,构建原核表达载体pET28a-COR15a,并将此重组质粒转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷( IPTG)诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,验证其蛋白表达量,并对其体系进行优化.[结果]AtCOR15a在大肠杆菌中成功表达,在37℃条件下诱导表达量最大,而30和16℃条件下蛋白表达量降低,IPTG浓度0.2～1.0 mmol/L对蛋白的表达量影响不大,并没有明显差异.但通过在不同诱导时间取样分析,结果发现加入IPTG后诱导5 h蛋白表达量最大,而8 h后逐渐降低.[结论]构建的原核表达载体在大肠杆菌中能高效表达,AtCOR15a融合蛋白分子量大约为19 kD,为进一步研究该基因的功能奠定了基础.