利用转基因技术生产C-反应蛋白的初步研究

利用转基因技术来获得C-反应蛋白,为廉价生产C-反应蛋白检测试剂盒奠定实验基础,同时初步建立一套利用转基因花生生产外源药用蛋白的实验技术体系。构建真核表达载体PBI121-CRP,利用根癌农杆菌介导法导入黑花生,使其在花生中表达,经分子生物学检测后,获得可表达CRP的转基因花生植株。其结果成功构建了真核表达载体,初步建立了黑花生再生体系,含目的基因的重组质粒转入根癌农杆菌后,共浸染105个外植体,经卡那霉素抗性筛选后得到56株抗性苗,PCR检测有13株呈阳性,经PCR-Southern杂交后,有2株出现杂交信号。初步建立黑花生再生体系,并首次成功地将CRP基因导入到植物(黑花生)中。     

CRP基因原核表达载体的构建和表达及其免疫原性检测

采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白。以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的CRP基因,将其克隆入表达载体pET28 a( )中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原性检测。成功地构建了CRP基因原核表达载体pET28 a( )-CRP,经IPTG诱导SDS-PAGE电泳分析表明C-反应蛋白能在大肠杆菌中获得表达,但免疫原性检测初步结果为阴性。结果证明CRP能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到大量表达,表达产物缺乏免疫原性,其机理还有待进一步试验探讨。     

黑花生再生体系和遗传转化的初步研究

以黑花生品种黑霸920成熟种胚、幼叶和胚轴为外植体，对黑花生植株再生和遗传转化进行了研究。通过设置一系列不同浓度激素配比的培养基来优化各阶段培养条件，初步建立了高效的黑花生再生体系，即花生种子经75％乙醇表面消毒15min，MS＋6-BA2．0mg／L为最优化的种子萌发培养基，MS＋2，4-D2．0mg／L为最佳诱导愈伤培养基，幼叶为最佳诱导愈伤组织的外植体，MS＋6-BA8mg／L＋NAA0．5mg／L＋AgNO3 1mg／L为最佳分化培养基，MS＋NAA2．0mg／L＋6-BA0．2mg／L＋活性炭200mg／L为最佳生根培养基。同时确定了愈伤组织和幼苗的卡那霉素筛选压分别为30mg／L和300mg／L。利用农杆菌介导法将含有GUS基因和NPTⅡ基因的植物表达栽体pBI121导入花生组织，在对愈伤组织、幼叶和胚轴的GUS表达检测中均有蓝色斑块出现，证明GUS基因已成功转入到花生细胞中。