仿刺参消化道内产琼胶酶菌株的选育及培养条件优化

对仿刺参Apostichopus japonicus消化道内容物进行富集培养,以琼胶为惟一碳源进行平板初筛,摇瓶复筛,得到一株琼胶酶活性较高的菌株HF3。对该菌株进行紫外线诱变,获得突变菌株HF3-04,酶活力从43.0 U/mL增加到48.9 U/mL,提高了13.7%。通过正交试验,确定培养基的最佳组成为:琼胶3 g/L,硝酸铵1 g/L,磷酸氢二钠0.5 mmol/L,pH值8.0;最佳培养条件为:接种量为1%,250 mL三角瓶中发酵培养基的装液量为110 mL,摇床转速为150 r/m in,培养温度为25℃,培养时间为48 h。将培养基组成及培养条件优化后,菌株酶活力达到80.7 U/mL,比优化前提高了65.0%。     

重组枯草芽孢杆菌发酵产青霉素G酰化酶的条件优化

【目的】研究提高PGA酶活力及稳定性.【方法】以重组枯草芽孢杆菌10397(pMA5-PGA)产PGA酶活力为研究对象,在单因素试验基础上,采用响应面设计,对重组菌发酵产PGA的培养基及发酵条件进行了研究.【结果】以葡萄糖20.39g/L、胰蛋白胨15.48g/L、糊精6.1g/L为培养基,在三角瓶装液量16.23%、接种量4.32%、温度35.43℃、时间48.34h、摇床转速220r/min的条件下,所产PGA的酶活力为14.167U/mL,比初始发酵条件下发酵重组菌产PGA的酶活提高了1.14倍.【结论】通过条件优化,可提高重组枯草芽孢杆菌PGA的酶活力,并为工业化生产PGA提供科学依据.     

陕北花马盐湖1株产纤维素酶真菌的鉴定及产酶条件研究

【目的】对从陕北花马盐湖嗜盐真菌中筛选出的1株产纤维素酶菌株进行鉴定,研究该菌株的产酶条件,为嗜盐纤维素酶资源的利用提供理论依据。【方法】利用刚果红培养基从陕北花马盐湖嗜盐真菌中筛选产纤维素酶菌株,并对其进行形态学和ITS序列鉴定,在单因素试验基础上,采用L9(34)正交试验,优化该产酶菌株的最佳培养基配方和最佳发酵条件,并研究该产酶菌株的NaCl耐受性。【结果】从陕北花马盐湖嗜盐真菌中筛选出1株高产纤维素酶菌株6MA1,根据形态学和ITS序列系统发育分析,将该菌鉴定为黑曲霉(Aspergillus niger)。菌株产纤维素酶的最佳培养基配方是,玉米芯粉22.0g/L,蛋白胨6.0g/L,NaCl 4.0g/L,MgSO4·7H2O 0.55g/L,K2HPO40.5g/L;最佳发酵条件是,发酵温度28℃,发酵时间6d,起始pH 6.0,种子液接种量18%(体积分数),在此条件下菌株6MA1的CMCase活力为47.8U/mL。此外,该菌株在含0~15.0%(体积分数)NaCl的培养基中仍具有产纤维素酶活力。【结论】从陕北花马盐湖筛选出1株产纤维素酶菌株6MA1,并得到了该菌株产酶的最佳条件。     

2株白腐真菌产漆酶条件的优化

采用液体摇瓶培养方法,探讨了碳源、氮源、pH值、培养温度等各种因素对白腐真菌分泌漆酶能力的影响,采用单因素和正交试验对主要的影响因素进行了优化。研究得出菌株的最佳产漆酶培养基为:200 g/L马铃薯+20 g/L葡萄糖+5 g/L酵母膏+1.5 g/L MgSO4+0.1 g/L维生素B1+0.05 g/L ZnSO4+0.05 g/L MnSO4+3.0 g/LKH2PO4。优化后的培养基最适发酵条件为:起始pH值6,转速130 r/min,装液量70 mL,在32℃条件下摇床培养发酵10 d左右时,粗酶液的酶活力达到12.7 U/g。     

新型产琼胶酶海洋细菌 Arthrobacter sp. ZXY772的分离鉴定及其应用

从广东省南澳岛采集龙须菜(Gracilaria lemaneiformis),分离出一株酶活性较高的琼胶酶产生菌,探究其应用价值,通过筛选培养基分离产琼胶酶的菌株,采用形态学和16S rRNA基因序列分析对菌株进行初步鉴定,构建系统发育树;采用DNS比色法对琼胶酶活性进行测定;初步探究菌株所产琼胶酶类型和酶解产物的抑菌效果。结果表明,经分离纯化得到一株产琼胶酶海洋细菌ZXY772,该菌株为革兰氏阳性球杆菌,属于节杆菌属(Arthrobacter sp.);胞外酶只产β-琼胶酶;该菌株于28℃、转速为180 r/min液体发酵培养基中振荡培养时,其生长对数期为3～14 h,当菌株摇床发酵至27 h,其琼胶酶活力到达最高96.0 U/mL;菌株粗酶液的酶解产物对枯草芽孢杆菌的抑制效果最强,其抑菌圈直径大小到达14.45 mm。     

白色噬琼胶菌QM38发酵产琼胶酶条件优化

采用正交试验法优化白色噬琼胶菌(Agarivorans albus)菌株QM38产琼胶酶的发酵条件,研究结果初步表明:蛋白胨5.0 g/L、酵母粉1.0 g/L、柠檬酸铁0.01 g/L、装液量1/4(150 ml三角瓶)、培养基琼脂浓度0.4%是其最适发酵条件,发酵48 h时产酶活性达到最高,为0.61 μmol/(L·min);23 h时菌种生长最旺盛,OD值为0.543.     

产κ-卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化

对K-卡拉胶酶产生菌进行富集培养,以K-卡拉胶为唯一碳源的平板初筛,从多种海藻上分离纯化获得32株具有卡拉胶酶活性的菌株,经摇瓶复筛,从亮管藻上分离的HC4菌株酶活力最高,为50．75U／mL。测定了HC4菌株的16SrRNA基因序列1436bp,在核苷酸序列数据库（NCBI）中进行同源性检索,发现它与Tatrtlana agarivorans的相似性为98％。通过单因子筛选和正交试验,确定该菌株产酶的最佳培养基组成为：碳源K-卡拉胶5g/L;氮源蛋白胨3g／L和NaNO3 1g／L;元机盐NaCl20g／L、K2HPO4·3H2O1g／L、MgSO4·7H2O 0．5g／L和CaCl20．1g／L。最佳培养条件为：摇床转速150r／min,250mL三角瓶中发酵培养基的装液量50mL,接种量4％,发酵培养基起始pH7．5,温度28℃,培养时间28h。经培养基组成及培养条件优化后,HC4菌株的K-卡拉胶酶酶活力提高到602．30U／mL,是优化前的11．87倍。     

产k-卡拉胶酶菌株的筛选及其发酵条件的优化

对K-卡拉胶酶产生菌进行富集培养,以K-卡拉胶为唯一碳源的平板初筛,从多种海藻上分离纯化获得32株具有卡拉胶酶活性的菌株,经摇瓶复筛,从亮管藻上分离的HC4菌株酶活力最高,为50．75U／mL。测定了HC4菌株的16SrRNA基因序列1436bp,在核苷酸序列数据库（NCBI）中进行同源性检索,发现它与Tatrtlana agarivorans的相似性为98％。通过单因子筛选和正交试验,确定该菌株产酶的最佳培养基组成为：碳源K-卡拉胶5g/L;氮源蛋白胨3g／L和NaNO3 1g／L;元机盐NaCl20g／L、K2HPO4·3H2O1g／L、MgSO4·7H2O 0．5g／L和CaCl20．1g／L。最佳培养条件为：摇床转速150r／min,250mL三角瓶中发酵培养基的装液量50mL,接种量4％,发酵培养基起始pH7．5,温度28℃,培养时间28h。经培养基组成及培养条件优化后,HC4菌株的K-卡拉胶酶酶活力提高到602．30U／mL,是优化前的11．87倍。     

哈茨木霉UN-2β-葡聚糖酶诱导及对水稻纹枯病的抑菌防病作用

【目的】优化哈茨木霉UN-2菌株产β-葡聚糖酶的培养基组分及发酵参数,提高其产酶能力,研究β-葡聚糖酶粗酶液对水稻纹枯病病原菌的拮抗作用及田间防效,阐明哈茨木霉菌株UN-2在水稻纹枯病生物防治中的应用潜力。【方法】采用单因素试验考察不同碳源、氮源和金属离子对哈茨木霉菌株UN-2产β-葡聚糖酶的影响,利用正交试验确定木霉菌株产β-葡聚糖酶的最适温度、pH、接种量、瓶装量、摇床转速和发酵时间,优化哈茨木霉菌株UN-2产β-葡聚糖酶诱导发酵条件;通过体外拮抗试验和田间防效试验研究β-葡聚糖酶粗酶液对水稻纹枯病的抑菌防病作用。【结果】哈茨木霉菌株UN-2发酵产β-葡聚糖酶最佳碳源和氮源分别为麦麸和硫酸铵,金属离子Ca²⁺和Mg²⁺对木霉产β-葡聚糖酶活性具有明显的促进作用。哈茨木霉UN-2菌株以10.0 g/L麦麸、0.5 g/L β-葡聚糖、4.0 g/L硫酸铵、1.5 mmol/L Ca²⁺、0.5 mmol/L Mg²⁺为培养基,在温度32℃、起始pH 6.5、接种量8 mL(10⁶      

除草活性菌株HZ-011发酵培养基筛选及其条件优化

【目的】明确除草活性菌株HZ-011的发酵培养基各因素配比及最适发酵条件,为该菌作为除草剂的研发和农田应用提供理论依据。【方法】以产孢量为目标,通过固体培养基筛选确定菌株HZ-011生长的基础培养基;采用单因素试验优化菌株HZ-011的发酵培养基和最佳发酵条件;利用中心组合设计（Central composite design,CCD）原理对菌株HZ-011的液体培养基成分及配比进行优化;通过响应面法分析培养基各成分间的交互作用;用菌株HZ-011发酵液对盆栽杂草（藜、密花香薷、冬葵和反枝苋）进行致病性试验。【结果】经过优化,菌株HZ-011的培养基最佳配比为蔗糖48.744 g/L、蛋白胨15.626 g/L、NaCl 0.214 g/L和K₂HPO₄ 0.428 g/L,最佳发酵条件为pH 7、温度25℃、培养时间5 d、装液量180 mL和转速180 r/min。盆栽试验结果表明,菌株HZ-011对藜和反枝苋全部致死,对密花香薷的致病率为75%,对冬葵的致病率为40%。【结论】优化后的培养基提高了菌株HZ-011的产孢量,为该菌株应用于农田杂草生物防治打下基础。     

青稞转录因子HvnANT1基因的克隆与表达分析

为探究HvnANT1基因在青稞粒色形成过程中的基因表达模式,以紫粒青稞‘涅如姆扎’和白粒青稞‘昆仑10号’为试材,利用简化基因组GBS(Genotyping-by-Sequencing)对青稞紫粒进行基因定位,克隆到HvnANT1基因,对其进行生物信息学分析。结果表明:1)在7H染色体的84.30—86.00 cM获得1个MYB类转录因子,命名为HvnANT1。2)该基因长1 033 bp,其完整开放阅读框为762 bp,编码253个氨基酸。HvnANT1蛋白分子量为27.14 kU,是亲水性的不稳定碱性蛋白且不存在跨膜结构,无信号肽。该蛋白的二级结构主要是由无规卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,具有2个SANT结构域(分别位于第13—第63个;第66—第114个氨基酸)。3)同源比对与系统进化分析表明:青稞HvnANT1蛋白与大麦、乌拉尔图小麦、高梁、玉米、二型花、小米、水稻、土瓶草、车轴草和杨梅10种植物的ANT1蛋白序列相似性分别为100.00%、88.85%、54.64%、60.95%、60.82%、58.46%、57.61%、37.76%、36.05%和36.33%;这些序列都具有2个高度保守的2个SANT结构域;与大麦的亲缘关系最近,其次是与乌拉尔图小麦,与水稻最远。4)亚细胞定位结果表明,该基因定位在细胞核内。5)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)结果显示:与籽粒颜色形成的乳熟早期和乳熟晚期相比,软面团期的HvnANT1基因在‘涅如姆扎’中表达量极显著上调,而在‘昆仑10号’中各时期的表达量较低且差异不显著;且软面团期的‘涅如姆扎’籽粒HvnANT1基因的表达量极显著高于‘昆仑10号’(P<0.01)。花青素合成相关的结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR与该基因表达量模式相似。综上,青稞HvnANT1蛋白结构中的SANT结构域在物种进化过程中比较保守;该基因定位在细胞核内,符合转录因子特性;HvnANT1基因表达模式与结构基因HvnCHI、HvnANS和HvnDFR相似,在籽粒颜色形成的软面团期表达量极显著升高。     

4种蝴蝶雄性生殖系统形态学研究

【目的】明确4种蝴蝶雄性生殖系统的形态学结构。【方法】将新鲜标本剪下腹部,在Motic SMZ168-BL型显微镜下观察解剖,用Q Imaging Retiga 2000R(CCD)显微成像系统照相,采用Montage图像叠加软件进行图像处理。【结果】描述了4种蝴蝶的雄性生殖系统,其中外生殖器的差异主要表现在囊形突、钩突、背兜、阳基轭片等上,而内生殖器的主要差异表现在精巢、复射精管、单射精管及附腺上。【结论】4种蝴蝶雄性生殖系统的各部分结构特征存在较大差异。     

乌梅等20种中药对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性研究

【目的】观察乌梅Fructus mume等20种中药的体外抗胸膜肺炎放线杆菌Actinobacillus pleuropneumoniae活性.【方法】通过乙醇回流、水煎煮和超声波等方法对20种中药进行提取,采用二倍稀释法测定其对胸膜肺炎放线杆菌的体外抗菌活性;并研究抗菌活性较强的几味中药的体外联合抑菌活性.【结果和结论】乌梅、黄连Rhizoma coptidis、诃子Terminalia chebula、秦皮Cortex fraxini、地榆Sanguisorbae officinalis、虎杖Polygonum cuspidatum 6种中药提取物对胸膜肺炎放线杆菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration,MIC)范围是6.25~50.00 mg/mL;大青叶Isatis indigotica、茵陈Artemisia capillaris、甘草Glycyrrhiza uralensis和白鲜皮Dictamnus dasycarpus 4种中药提取物的MIC范围是50.00~100.00 mg/mL;黄柏Phellodendron amurense、杜仲Eucommia ulmoides、金银花Lonicera japonica、柴胡Bupleurum chinense、蒲公英Taraxacum mongolicum、板蓝根Baphicacanthus cusia、栀子Gardenia jasminoides和黄芪Astragalus membranaceus等10种中药提取物的MIC100.00 mg/mL.联合抑菌试验结果表明,乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合抑菌指数(FICI)≤1,乌梅、虎杖分别与秦皮的FICI2.乌梅、黄连、诃子、虎杖、秦皮、地榆对胸膜肺炎放线杆菌均具有较好的体外抗菌活性;乌梅、黄连、诃子和虎杖两两联合为相加、协同作用;秦皮分别与乌梅、虎杖为拮抗作用.     

岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究

【目的】研究岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性。【方法】采用组织分离法分离纯化魔芋软腐病球茎及叶柄中的致病菌,通过魔芋球茎、胡萝卜及马铃薯块的侵染试验初步确定其致病性,再利用魔芋球茎侵染致病及盆栽致病性试验确认其致病性;经菌落与细胞形态、生理生化特性及16SrRNA序列测定确定病原菌的类型。【结果】从魔芋软腐病球茎及叶柄中共分离获得16株细菌,侵染试验表明,其中CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1、CDS2-B2、CZS-B4和CZS-B6共6株细菌可使魔芋球茎表现软腐症状,并导致盆栽魔芋发病;6株细菌的菌落与细胞形态均存在差异;在魔芋、胡萝卜及马铃薯块上的侵染能力不同;16SrRNA序列分析表明,菌株CDS1-B1、CDS1-B2、CDS2-B1及CDS2-B2均与菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)亲缘关系最近,菌株CZS-B4与菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)亲缘关系最近,相似度为98.8%,菌株CZS-B6与菊果胶杆菌(Pectobacterium chrysanthemi)的相似度达99.9%。【结论】导致岚皋县魔芋软腐病的致病细菌存在生物多样性,其致病性也存在差异,其中新发现的魔芋软腐病原菌菊果胶杆菌(Pecto-bacterium chrysanthemi)致病性最强,菊欧氏杆菌(Erwinia chrysanthemi)和菊欧文氏菌(Dickeya dadantii)致病性较弱。     

摘除眼柄与注射眼柄粗提物对凡纳滨对虾性腺发育相关基因表达的影响

利用荧光定量PCR技术,检测了眼柄粗提物对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)性腺发育相关基因(DMC1、VASA和VTG)表达的影响,探讨性腺抑制激素(GIH)在性腺发育过程中的调控机制,结果表明:DMC1和VASA只在凡纳滨对虾精巢和卵巢中表达;摘除眼柄后,精巢和卵巢中DMC1表达量均显著性降低(P0.05),而注射眼柄粗提物后精巢和卵巢中DMC1表达显著增高(P0.05);相反,摘除眼柄后,精巢和卵巢中VASA以及卵巢中VTG基因表达量显著增高,但注射眼柄粗提物后性腺中的VASA和卵巢中的VTG表达量显著降低。结果表明眼柄粗提物通过影响生殖相关基因的表达影响凡纳滨对虾的性腺发育。     

细粒棘球蚴重组St-Eg 95-Eg.ferritin疫苗构建及生物学特性检测

构建表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的重组口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株并评价其生物学特性。将细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,将重组质粒分别电转入减毒鼠伤寒沙门菌X3770和X4550,获得重组疫苗菌株St-Eg95-Eg.ferritin,对重组菌的稳定性、生长状态及安全性进行分析。结果表明,经PCR和酶切鉴定成功构建重组质粒pYA3341-Eg95-Eg.ferritin,Western blot检测Eg95-Eg.ferritin蛋白在重组菌中获得表达;生物学特性研究结果表明,重组质粒可稳定存在,且不影响重组菌的生长状态,小鼠口服试验证实,重组菌安全无毒性。成功构建能稳定表达细粒棘球蚴Eg95-Eg.ferritin融合蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门菌活载体疫苗株,将为研究包虫病口服基因工程疫苗奠定基础。     

四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1与ESBLs基因共转移分析

为了解四川省食品动物源大肠杆菌mcr-1耐药基因流行情况,及其与超广谱β-内酰胺酶基因(ESBLs)共存和共转移的特征,采用微量肉汤稀释法检测菌株对不同抗菌药物的敏感性;采用PCR检测菌株mcr-1,以及mcr-1阳性菌株中ESBLs基因类型;采用质粒接合转移试验分析了mcr-1与ESBLs基因共转移的耐药机制。结果显示:190株大肠杆菌的mcr-1检出率为36.84%,75.71% mcr-1阳性菌株中同时检出ESBLs基因,主要以blaTEM-1、blaCTX-M-55和blaCTX-M-14为优势基因;mcr-1阳性菌对氨曲南(ATM)、头孢噻肟(CTX)和多黏菌素E(COL)耐药率极显著高于mcr-1阴性菌(P<0.01);质粒转移率为47.14%,其中获得mcr-1和ESBLs基因共转移的接合子表现出与供体菌相同的耐药表型及耐药基因。综上,在四川省食品动物源大肠杆菌中,mcr-1与ESBLs基因共存现象广泛存在,且耐药基因易发生水平传播,对菌株多重耐药性的产生具有重要意义。     

绣线菊内生真菌的分离及对植物病原菌的抑制作用

采用组织分离法,以PDA培养基为分离培养基,从绣线菊的根、茎和叶中分离获得39株内生真菌。平板对峙结果表明, 21株活性菌株对6种植物病原菌（辣椒疫霉病原菌、番茄枯萎病原菌、苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、葡萄灰霉病原菌、小麦赤霉病原菌）有不同程度的抑制作用,其中菌株XXT10对苹果腐烂病原菌、苹果炭疽病原菌、番茄枯萎病原菌、小麦赤霉病原菌的抑制率分别达到73.2%、72.5%、39.5%和42.7%。通过测得的ITS rDNA 序列与GenBank数据库中已知序列比对后该菌为链格孢属菌。生物学特性试验表明,该菌株在28～32℃时,选择PDA培养基,分别以乳糖和蛋白胨作为碳、氮源,酸碱度中性的条件下,菌落的生长状况最佳。     

扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因serpin部分片段克隆及不同体节mRNA转录水平分析

旨在初步了解丝氨酸蛋白酶抑制剂基因在扩展莫尼茨绦虫生长发育中的作用。采用分子克隆获得扩展莫尼茨绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因部分片段,应用MEGA软件对其进行进化分析。同时以beta-Tubulin基因作为内参基因,采用SYBR Green real-time RT-PCR技术检测该基因在扩展莫尼茨绦虫4个不同发育阶段即头节、幼节、成节、孕节中的表达差异,最终克隆获得749bp的serpin基因片段。进化分析表明,扩展莫尼茨绦虫serpin基因与多方棘球蚴serpin基因有较近的亲缘关系。标准曲线分析显示,serpin和beta-Tubulin基因的Ct值与阳性质粒的浓度均呈良好的线性关系,相关系数均大于0.99,熔解曲线分析表明,产物为特异的单峰,具有较高的特异性。同时试验结果显示,serpin基因在虫体各发育阶段中的表达丰度存在差异,从高到低依次为孕节、头节、成节、幼节。由此初步推测,此基因可能在扩展莫尼茨绦虫虫卵发育为六钩蚴的过程中发挥一定作用。     

孟加拉鲥、美洲鲥和中国鲥形态学比较分析

观察、解剖107尾孟加拉鲥Tenualosa ilisha、美洲鲥Alosa sapidissima和中国鲥Tenualosa reevesii,详细记叙了孟加拉鲥外部形态和内部结构,运用传统形态学方法比较分析了3种鲥鱼的形态差异.三者形态7项可量性状比值的聚类分析结果显示,孟加拉鲥和中国鲥先聚为一类,再和美洲鲥聚为一类,这与它们的分类地位相一致.外观上,孟加拉鲥臀鳍鳍条短,被1层薄鳞覆盖;美洲鲥的纵列鳞数及体长/体高、体长/头长都大于其他2种鲥鱼.可数性状上,第一外鳃弓鳃耙和脊椎骨数目能明显区分3种鲥鱼.孟加拉鲥、中国鲥和美洲鲥的第一外鳃弓鳃耙数分别为181～219+153～224、95～131+170～175和24～31+47～55;脊椎骨数分别为46～48、37～39和55～57.在内部结构上,根据胃的形状、盲囊部的大小、幽门垂的长短和数量、肠道的弯曲数目及相对长度可以准确鉴定这3种鲥鱼.孟加拉鲥肠道最长,中国鲥次之,美洲鲥肠道最短.3种鲥鱼在消化道结构的差异,预示食性已产生分化.