猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

尼罗罗非鱼Lck多克隆抗体的制备及鉴定

[目的]制备及鉴定尼罗罗非鱼淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(Lck)多克隆抗体,为深入研究罗非鱼Lck蛋白功能及其免疫机制打下基础.[方法]采用无缝克隆技术构建重组质粒pET-B2m-Lck,然后转入大肠杆菌B21(DH3)中进行诱导表达;经Ni-NTA树脂层析柱纯化后,以纯化的融合蛋白免疫日本大耳白兔制备Lck多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性和免疫效价.[结果]尼罗罗非鱼Lck蛋白的亲水性均值(GRAVY)为-0.454,属于亲水性蛋白,具有较丰富且分布均匀的潜在抗原表位位点,无典型的跨膜区.经原核载体诱导表达获得的融合蛋白分子量约67.0 kD,主要以包涵体形式存在.免疫日本大耳白兔后可获得效价为1:256000的Lck多克隆抗体,且该多克隆抗体能特异性识别Lck蛋白.经Protein G亲和层析柱纯化的抗体浓度在10 mg/mL以上,纯度约95%,抗体纯化效果良好.[结论]经原核载体诱导表达获得的尼罗罗非鱼Lck融合蛋白具有良好的免疫原性,其免疫日本大耳白兔后获得的多克隆抗体具有高效价和特异性,可用于细菌感染罗非鱼后机体免疫机制的研究.     

TeiR融合蛋白分离及多克隆抗体的制备

提取睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)基因组DNA,PCR扩增teiR基因,将扩增产物克隆到pET28a中,经酶切验证后获得teiR基因表达载体pET28a-teiR.将重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21,添加终浓度为1 mmol.L-1的IPTG进行诱导,提取细菌总蛋白进行蛋白的SDS-PAGE电泳.并根据融合蛋白特性,利用Ni-NTA Spin Column对TeiR融合蛋白进行分离纯化,经分离纯化后的重组蛋白在SDS-PAGE上呈现出单一条带.进一步以获得的TeiR融合蛋白为抗原,制备兔抗TeiR多克隆抗体,经ELISA测定该抗体的效价为1∶10000,该抗体与睾丸酮丛毛单胞菌天然TeiR蛋白反应良好,说明该抗体特异性良好.     

牛病毒性腹泻病毒Core蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的Core蛋白及其多克隆抗体,根据Core蛋白的编码基因序列,设计合成一对特异性引物,利用RT-PCR扩增BVDV Core基因并定向插入Pet30a载体中,构建重组质粒Pet30a-Core,经酶切鉴定后转化大肠埃希菌TOP 10感受态细胞,筛选获得阳性重组菌,以IPTG进行诱导后成功表达出分子质量为20 ku的重组Core蛋白。将诱导表达的蛋白产物经融合蛋白的Ni柱亲和法进行纯化,利用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,并利用间接ELISA法测出多克隆抗体效价达到1∶512 000。蛋白质印迹法(Western blot)和间接免疫荧光试验(IFA)证实,多克隆抗体可与细胞中的BVDV抗原发生反应,具有良好的免疫原性和特异性。本实验成功制备了BVDV重组Core蛋白的兔源多克隆抗体,为BVDV的检测及其Core蛋白功能研究奠定了基础。     

弓形虫棒状体蛋白15的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

【目的】克隆弓形虫（Toxoplasma gondii）RH虫株速殖子的棒状体蛋白15(ROP15)基因,原核表达、纯化重组蛋白,并制备多克隆抗体。【方法】根据GenBank登录的弓形虫RH株ROP15(DQ096561.1)基因序列设计了1对引物,以提取的弓形虫RH虫株速殖子RNA为模板,通过RT-PCR获得该虫株的ROP15基因,将该基因连接至原核表达载体pGEX-4T-1上,获得重组质粒pGEX-4T-ROP15,测序结果与预期结果一致;转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导获得重组融合蛋白,运用亲和层析法纯化可溶性ROP15重组蛋白,SDS-PAGE对表达和纯化的目的蛋白进行分析。用纯化的ROP15重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,运用Western blot分析特异性。【结果】成功克隆了弓形虫RH虫株速殖子ROP15基因,大小为924 bp;菌液PCR和酶切鉴定表明重组质粒pGEX-4T-ROP15构建成功,获得了约59 ku的可溶性融合蛋白表达产物;以纯化的可溶性ROP15重组表达蛋白为抗原制备兔源性抗血清,Western blot显示该多克隆抗体与ROP...     

BLCAP蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

目的:利用原核表达系统表达BLCAP融合蛋白并制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a( )-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达并采用亲和层析的方法纯化和SDS-PAGE鉴定后免疫日本大耳白兔,制备BLCAP蛋白多克隆抗体并检测其特异性。结果:经过IPTG诱导,获得分子量大小约为28ku的融合蛋白,用纯化得到的融合蛋白免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP蛋白的多克隆抗体,通过Western blot检测证明该抗体能够与BLCAP融合蛋白发生特异性结合。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性,制备的抗BLCAP的多克隆抗体特异性较好,为今后进一步研究BLCAP蛋白性质与功能奠定了基础。     

斑马鱼血管新生相关因子PTPRB的原核表达及其多克隆抗体制备

【目的】原核表达斑马鱼（Danio rerio）蛋白酪氨酸磷酸酶受体B（PTPRB）并制备多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB基因功能及血管发育相关信号传导通路打下基础。【方法】采用无缝克隆技术将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m构建重组表达质粒,转化大肠杆菌B21感受态细胞后采用IPTG进行诱导表达,然后以诱导表达的融合蛋白免疫大耳兔制备多克隆抗体,并采用Western blotting和ELISA检测多克隆抗体的特异性及免疫效价。【结果】斑马鱼PTPRB蛋白亲水性均值为-0.490,属于亲水性蛋白,且具有较丰富的潜在抗原表位位点,分布均匀,无典型的跨膜区。将斑马鱼PTPRB基因插入原核表达载体pET-B2m成功构建获得重组表达质粒pET-B2-PTPRB,转化B21感受态细胞后经IPTG诱导表达,即获得35.0 kD的融合蛋白。融合蛋白PTPRB主要以包涵体形式存在;以纯化融合蛋白PTPRB免疫大耳兔,其血清抗体效价为1∶2048000,说明采用融合蛋白PTPRB可有效刺激大耳兔产生较强的免疫反应,获得较高效价的PTPRB多克隆抗体。Western blotting检测结果显示,PTPRB多克隆抗体具良好抗原特异性。采用Protein A/G亲和层析柱对制备获得的PTPRB多克隆抗体进行亲和层析纯化,可获得高纯度的多克隆抗体,纯化后的PTPRB多克隆抗体浓度在10 mg/mL以上。【结论】构建的斑马鱼PTPRB基因原核表达载体能高效表达具备良好免疫原性的融合蛋白PTPRB,以融合蛋白PTPRB免疫大耳兔可获得高效价、高特异性的PTPRB多克隆抗体,为研究斑马鱼PTPRB蛋白功能提供有利工具,也为揭示PTPRB在鱼类血管发育中的作用机制提供技术支持。     

猪STAT-1α基因的原核表达及其多克隆抗体制备

[目的]通过制备STAT-1α多克隆抗体,为进一步研究STAT-1α蛋白的功能特性及探索STAT-1α与猪瘟病毒间的相互作用机制奠定基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾PK-15细胞中克隆出STAT-1α基因保守片段,与pET-32a（＋）构建原核表达重组质粒,转化原核宿主菌（Rosetta）,进行IPTG诱导表达,表达的重组蛋白经纯化和复性浓缩后,免疫小鼠制备STAT-1α多克隆抗体.[结果]STAT-1α基因能与原核表达载体pET-32a（＋）构建原核表达重组质粒pET-STAT-1o,转化大肠杆菌Rosetta后的最佳体外诱导条件是IPTG 0.5 mmol/L、诱导时间6h,其重组蛋白主要以包涵体的形式表达.STAT-1α多克隆抗体具有高效特异性,与真核细胞PK-15细胞作用后,在PK-15细胞内能检测到STAT-1α蛋白表达,可观察到大部分细胞胞浆内有绿色荧光,但胞核内几乎无荧光,即STAT-1α主要定位在正常PK-15细胞的细胞浆内表达.[结论]制备获得的猪STAT-1 α多克隆抗体特异性好,既能与原核细胞大肠杆菌（Rosetta）表达的STAT-1α反应,又能与真核细胞PK-15的STAT-1α发生反应.     

非洲猪瘟病毒UBCv1的原核表达及多抗制备

[目的]为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)泛素结合酶(UBCv1)的生物学功能及致病机制奠定基础.[方法]以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白.重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性.[结果]成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7290000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性.[结论]成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料.     

猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基配体结合域的原核表达和多克隆抗体制备

病毒受体是决定病毒宿主特异性和组织嗜性的重要因素.利用原核细胞表达了猪口蹄疫病毒受体整合素β8亚基的配体结合域(LBD)片段,分离纯化目的蛋白后免疫兔,制备兔多克隆抗体.以含有猪β8亚基全长cD-NA的质粒为模板,经PCR扩增得到位于β8成熟肽氨基端的LBD基因片段,与带有GST标签的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β8LBD,测序确认读码框正确后,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达重组β8LBD融合蛋白.通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后提取包涵体,以电泳分离纯化的重组融合蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,鉴定血清效价和特异性.结果显示,实现了重组猪β8LBD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示分子量约为46 000,主要以包涵体形式存在于菌体中.制备的兔多克隆抗体效价达1∶12 800以上,该血清可与目的蛋白发生特异性反应.这将为进一步研究猪整合素β8亚基在宿主体内的分布及其在口蹄疫病毒致病过程中的作用奠定基础.