兔出血症病毒经典毒株和变异毒株的RT-PCR鉴定

本研究旨在建立鉴别兔出血症病毒经典毒株(RHDV)和变异毒株(RHDV2)的RT-PCR检测方法。根据Gen Bank中经典RHDV和RHDV2的VP60基因序列,设计2对分别结合两种基因的特异性引物。利用2对引物,以人工合成RHDV2的VP60基因构建的p MD19-T-VP60-2和p MD19-T-VP60为模板,进行RT-PCR体系退火温度的优化,优化后的退火温度为58.2℃。对优化后的RT-PCR体系进行RHDV和RHDV2的敏感性试验、特异性试验,并用于检测RHDV人工感染样品和疑似临床样品,结果显示,该方法具有良好的特异性和敏感性,经典RHDV和RHDV2的检测限度分别为95拷贝和76拷贝的靶基因片段,且对支气管败血波氏杆菌、多杀性巴氏杆菌、产气荚膜梭菌、大肠杆菌等病原以及重组质粒p MD19-T-EBHSV的检测结果均为阴性。RHDV人工感染的组织样品检出率为100%,15份临床样品中3份为经典RHDV阳性,其他均为经典RHDV及RHDV2阴性。该方法的建立能够实现快速、特异及敏感地检测RHDV和RHDV2,为监测RHDV变异株的流行情况提供技术支撑。     

兔出血症病毒RT-PCR检测方法的建立及临床应用

为建立检测兔群鼻拭子中兔出血症病毒(RHDV)的RT-PCR方法,研究健康免疫兔群是否存在携带RHDV现象,根据GenBank上公布的RHDV vp60基因保守序列,设计了1对特异性引物,经cDNA合成和PCR扩增,目的片段大小为586 bp.结果表明该方法能检出最小RNA浓度为2.4 ng/L,敏感性为血凝试验8 000倍.通过对来自泰州市5个地区采集的100份健康免疫兔鼻拭子样品进行检测,结果显示,阳性样品为11份,阳性率为11％.表明RT-PCR方法能快速、敏感地从健康免疫兔鼻拭子样品中检出RHDV,提示健康免疫兔群存在携带RHDV的现象.     

猪传染性胃肠炎病毒S基因的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测

为建立猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测方法,根据GenBank收录的TGEV-Miller毒株的S基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从疫苗株中扩增TGEV S基因的部分保守片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量RT-PCR检测...     

猪hsp70和hsp90荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据hsp70、hsp90和GAPDH基因mRNA序列,设计并合成3对引物,将PCR扩增的基因片段克隆到pGEM-T载体,重组质粒经筛选、鉴定,体外转录出RNA,系列稀释作为阳性标准品,用于标准曲线的绘制和样品检测,并用持家蛋白GAPDH基因对样品进行归一化,建立了一步法实时荧光定量RT-PCR技术平台,并对其扩增效率、敏感性、特异性进行了检测.结果证明,建立的一步法荧光定量RT-PCR技术可以真实地反映反应管中模板的数量,可用于猪hsp70、hsp90和GAPDH基因mRNA水平的检测.     

牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒与牛冠状病毒三重RT-PCR方法的建立与应用

为建立快速同步检测牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒与牛冠状病毒的多重RT-PCR检测方法并应用于临床检测。根据GenBank中三种病毒参考毒株的基因序列,设计3对特异性引物。利用构建的三种病毒的标准质粒进行三种病毒的三重RT-PCR方法,进行特异性、敏感性和重复性检验,并进行临床样品检测。特异性结果显示,建立的牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的三重RT-PCR方法可特异性扩增出阳性标准质粒的基因片段,对牛源沙门氏菌、大肠杆菌、牛巴氏杆菌、牛支原体无扩增;敏感性结果显示,对牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒质粒核酸最低检测浓度分别为250、 250和25ng/mL。重复性结果显示,能扩增出一致的目的基因条带。临床样品结果显示,三重RT-PCR方法和单一RT-PCR符合率100%。可见,建立牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的三重RT-PCR方法特异性强、敏感性高、重复性好,可进行临床检测。     

禽白血病病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR检测方法建立和应用

针对禽白血病毒p27基因保守区,设计引物和探针人工合成基因片段,连接到载体,构建重组质粒禽白血病-p27,以重组质粒禽白血病-p27为模板进行条件优化,建立禽白血病病毒Taq Man-MGB荧光定量PCR检测方法。验证试验表明方法特异性强,不与其他常见禽的病原发生反应。重复性试验表明该方法具有较好的稳定性,检测灵敏度达到1.68×10copies/μL。同时,应用该方法对临床68份样品进行检测,检出阳性样品26份,与商品试剂盒做对比,二者符合率100%。结果表明建立的方法特异性强,敏感性高,实用性强,为禽白血病净化提供了技术支撑。     

禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒多联RT-PCR诊断方法的建立

利用分子生物学方法,选择禽流感病毒的M基因、新城疫病毒的F基因以及传染性支气管炎病毒的N基因,分别在基因序列的保守区域设计1对特异性引物,利用所合成的3对引物对相应靶基因进行RT-PCR扩增,在优化单项RT-PCR条件的基础上,建立禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒多联RT-PCR的检测方法,同时对该检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这3对引物分别能特异性地扩增出禽流感病毒的M基因片段、新城疫病毒的F基因片段及传染性支气管炎病毒的N基因片段,大小分别为385 bp、520 bp和748 bp,初步建立了快速、敏感、特异鉴别检测禽流感、新城疫、传染性支气管炎病毒的分子诊断方法。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因β-actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18-T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β-actin的标准曲线.结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R2均在0.99以上;最小检出量为10拷贝/μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异.可见,SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点.     

兔出血症病毒衣壳蛋白重组腺病毒的构建、表达及其免疫原性

通过RT-PCR方法扩增上海地区兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白基因(VP60).将其克隆入腺病毒表达载体系统中,构建成重组腺病毒质粒,用脂质体法转染HEK293细胞,得到重组病毒pAd-VP60,经RT-PCR、IFA、HA、SDS-PAGE和Western-blotting鉴定,结果表明重组VP60蛋白在HEK293细胞中获得表达.表达产物与铝胶佐剂混合后注射3月龄非免疫健康家兔,结果表明,免疫后21 d兔体内产生抗RHDV抗体,其HI效价可达2~6～2~7,能抵御HA≥2~(10)致死剂量RHDV强毒的攻击,保护率为100%.     

猪圆环病毒2型实时定量PCR检测方法的建立

用PCR技术从一临床病猪组织中扩增出猪圆环病毒2型（PCV2）417 bp片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有PCV2基因片段的重组质粒。应用该重组质粒进行实时荧光定量PCR,建立了PCV2 DNA的实时PCR标准曲线及其直线回归方程。结果显示该方法重复性好,其检测灵敏度达到102拷贝/μL,检测样品时特异性强。此研究表明,所建立的PCV2 DNA实时定量PCR方法具有重复性好、敏感性高与特异性强等特点,能够用于PCV2的定量检测。     

新型鸭呼肠孤病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL^-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。     

鸭副粘病毒与H9亚型禽流感病毒双重PCR检测方法的初步建立

通过对GenBank发表的鸭副粘病毒(DPV)和鸭H9亚型禽流感病毒(AIV,H9)基因序列分析,针对保守区分别设计并合成2对特异性引物.通过对扩增条件的优化,建立了检测两种病毒的快速双重PCR方法.结果表明,该检测方法可同时扩增出DPV (363 bp)和H9亚型AIV (732 bp)的特异性片段,而对照DHV、I...     

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立

为建立PCV1和PCV2混合感染快速检测的PCR方法,根据GenBank已发表PCV1和PCV2全基因组序列,设计合成4条引物,通过PCV1和PCV2阳性质粒的构建、反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,建立了PCV多重PCR检测方法,可扩增出PCV1和PCV2长度分别为726 bp和433 bp特异性目的基因片段。结果显示,建立的PCV多重PCR可检测到5×101个拷贝的PCV1和PCV2目的基因,HCV、PRV、PPV核酸扩增均为阴性,具有良好的特异性和敏感性。并初步应用建立的方法对42份采自四川省部分地区的样品进行检测,结果表明,PCV1阳性率为33.3%,PCV2阳性率为45.2%,其中PCV1和PCV2混合感染阳性率为16.6%。     

基于荧光熔解曲线模式RT-PCR快速检测H5N1亚型禽流感病毒

针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)的HA、NA基因保守序列设计2对引物,建立了SYBR Green Ⅰ双重荧光RT-PCR(RRT-PCR)方法,实现了同一反应管内同时检测AIV的H5和N1亚型基因.熔解曲线分析显示,H5和N1扩增片段的熔解温度分别为(795±03)℃和(833±03)℃,无引物二聚体形成,扩增产物片段大小分别为150bp和474bp,与预期大小相符,测序结果证实为H5和N1亚型基因的靶序列.该方法能从H5N1样本中检出阳性扩增信号,熔解曲线可见H5和N1双特异峰;而H5N2样本有阳性扩增,熔解曲线仅见H5单特异峰.AIV的其他HA亚型和其他病毒的RNA、DNA 无扩增信号.本法最低可检测210拷贝·μL-1和195拷贝·μL-1 H5和N1重组质粒,敏感度分别是RT-PCR的100、1 000倍.本研究建立的基于荧光熔解曲线模式RT-PCR可用于H5N1亚型AIV的检测.     

猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2, PCV2）,是感染猪Sus scrofa domestica的一种单链DNA病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法,对于PCV2感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计了荧光定量聚合酶链式反应（PCR）引物,利用SYBR Green作为荧光染料建立了一种定量检测PCV2的PCR方法。结果表明:该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,每微升的最低检测限低至101拷贝DNA。利用该方法对34份PCV2阳性临床样本进行检测,检测符合率为100%,明显高于普通PCR方法的50.0%。因此,本研究建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法为该疾病的预防和控制提供一种有效的检测工具。图4表4参26     

猪传染性胃肠炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

针对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因的保守序列设计引物,以TEGV疫苗毒株为模板,克隆S基因,并构建重组阳性质粒,优化反应体系和扩增条件,建立基于SYBR GreenⅠ染料的实时荧光定量PCR检测方法,并对其特异性、重复性和灵敏度进行分析。结果显示:建立的检测方法灵敏度可达10拷贝/μL,标准曲线线性关系良好(r=0.997),扩增效率高,具有良好的特异性和重复性。使用该方法对124份临床疑似TGEV病料进行检测,阳性样本有17份,检测样本的阳性率为13.7%。该方法可用于兽医临床上TGEV的快速检测和流行病学分析。     

兔出血症病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

兔病毒性出血症（rabbit hemorrhagic disease, RHD）是一种具有高度传染性的疾病,严重威胁养兔业的健康发展。为了建立一种能够快速、高效、敏感的检测RHDV的方法,试验设计了一对特异性引物进行PCR扩增,得到RHDV VP60基因中979 bp的保守序列,并将其克隆到pMD19 T载体中作为标准品建立标准曲线;在扩增区域内设计一对简并引物,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,优化反应条件,并验证该方法的敏感性、特异性、重复性。结果表明：该方法可检测到的模板的最低拷贝数为8.18×101 copies,只能特异性扩增RHDV,pGM19 T EBHSV、兔巴氏杆菌、兔沙门氏菌、兔大肠埃希菌和健康兔组织RNA的扩增均为阴性,具有良好的特异性和重复性;同时用此方法对人工感染家兔的内脏分别进行检测,结果表明SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR能快速检测到不同脏器中的兔病毒性出血症病毒RNA含量,可用于临床兔瘟病毒的检测。     

猪细小病毒NS1蛋白的截短表达与间接ELISA诊断方法的建立

【目的】建立一种快速检测猪细小病毒（Porcine parvovirus,PPV）野毒抗体的方法。【方法】参照已发表的PPV基因组（AY502114.1）序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增PPV-NS-1基因主要抗原区域,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化BL21（DE3）表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。以该蛋白作为诊断抗原,经过对间接ELISA条件的优化,建立检测PPV抗体的NS1-ELISA诊断方法,对该方法的特异性、敏感性、重复性进行检测。用建立的PPV NS1-ELISA诊断方法和血凝抑制试验（HI）同时对临床送检的306份血清样品进行检测,比较二者的符合率。【结果】成功扩增了870 bp的NS1基因部分片段,构建了pET30a-NS1原核表达载体,获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。以纯化蛋白作为诊断抗原,建立了检测猪细小病毒抗体的NS1-ELISA诊断方法。该方法与猪圆环病毒2型（PCV-2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪乙脑病毒（JEV）、猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪瘟病毒（CSFV）等7种常见猪病病毒的阳性血清均不发生反应;该方法检测敏感性为1∶12 800;批内重复性试验和批间重复性试验中样品的变异系数分别小于5%和10%。PPV NS1-ELISA检测方法与HI的符合率为96.2%。【结论】制备了NS1重组蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,以其作为包被抗原建立的PPV NS1-ELISA诊断方法具有良好的重复性、敏感性和特异性,为PPV的快速诊断和流行病学调查等提供了一种快速、简便的血清学诊断方法。