猪圆环病毒2型SYBR—Green 1实时荧光定量PCR检测方法的建立

【目的】建立一种能够快速、灵敏地检测猪圆环病毒2型(PCV2)的SYBR-Green 1实时荧光定量PCR方法。【方法】根据已报道的PCV2ORF2基因组序列,设计并合成1对引物。通过常规PCR扩增PCV2ORF2基因,将鉴定正确的ORF2基因片段克隆入pTG19-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-Green 1荧光定量PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。【结果】PCV2荧光定量PCR标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,溶解曲线特异,相关系数为0.9988,最低检测的拷贝数为1拷贝/25μL,特异性和重复性较好。【结论】建立了检测PCV2的SYBR-Green 1荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断及定量分析PCV2感染程度奠定了基础。     

猪圆环病毒2型实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪圆环病毒2型（porcine circovirus 2, PCV2）,是感染猪Sus scrofa domestica的一种单链DNA病毒。建立一种快速、灵敏的检测方法,对于PCV2感染猪的筛选和疾病预防非常重要。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计了荧光定量聚合酶链式反应（PCR）引物,利用SYBR Green作为荧光染料建立了一种定量检测PCV2的PCR方法。结果表明:该方法具有灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,每微升的最低检测限低至101拷贝DNA。利用该方法对34份PCV2阳性临床样本进行检测,检测符合率为100%,明显高于普通PCR方法的50.0%。因此,本研究建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法为该疾病的预防和控制提供一种有效的检测工具。图4表4参26     

Taqman探针实时定量PCR检测猪伪狂犬病毒

选取猪伪狂犬病毒(PRV)基因组中gE基因,设计特异性引物和Taqman探针,利用实时定量PCR来定量检测PRV.利用PCR技术扩增猪伪狂犬病毒gE基因80 bp片段,并克隆到pMD18-T载体上,阳性重组质粒命名为pgE80.pgE80质粒进行10倍系列稀释,作为荧光PCR检测的标准模板,定量拷贝数,并绘制标准曲线.以提取的PRV、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)和传染性胃肠炎病毒(TGEV)的DNA作为模板,进行特异性检测.该实时定量PCR方法,标准曲线斜率为-0.37,R2=0.992,可以检测到20个拷贝数.PRV能被扩增出S型荧光曲线,而其它病毒均未能扩出.用PRV强毒肌肉注射仔猪,定量PCR比普通PCR更能灵敏而特异地检出呼吸道排毒和血液带毒.建立的实时定量PCR方法可用于临床样品快捷、准确、方便地检测.     

水稻OsCKX2基因表达实时荧光定量PCR检测技术的建立

从水稻花序分生组织总RNA中逆转录扩增总cDNA,PCR扩增OsCKX2基因中设计的目的片段,将纯化的目的片段克隆到pMD19-TSimple载体中,PCR鉴定并测序分析,制备成荧光定量PCR梯度浓度质粒标准品。对重组质粒进行实时荧光定量PCR实验。标准曲线结果表明,建立的OsCKX2基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法,特异性好,灵敏度高,可达102拷贝;线性范围广,可达1.0×102~1.0×107拷贝;扩增效率高(E=95.9%);稳定性、重复性好,可靠性高,批内和批间变异系数(CV)仅为:0.14%~0.29%和0.16%~0.35%;循环阈值与PCR体系中起始模板量的对数值之间有着良好的线性关系(r=1.000),可对OsCKX2基因表达进行准确实时定量。一个基于TaqMan实时荧光定量RT-PCR技术,定量分析控制水稻谷粒数关键基因之一OsCKX2转录水平的技术体系被成功建立。该技术体系重组质粒标准品的制备方法具有很强的实用性;对基因OsCKX2的表达实时定量准确、可靠、便捷。     

伪狂犬病病毒gB基因荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增伪狂犬病病毒(PRV)的gB基因片段,构建含有gB基因片段的重组质粒,以不同浓度的PRV-gB基因重组质粒为模板应用SYBR Green I方法来建立检测PRV-gB基因载量的荧光定量PCR方法。结果显示:在(8.6×107~8.6×101)copies/μL范围内,回归方程为y=-3.5604x+41.165,其决定系数为0.9993,显示出优良的线性关系;扩增产物的熔解曲线仅有一个特异性单峰。该方法对猪圆环病毒、猪细小病毒、猪细环病毒等常见猪源DNA病毒进行检测时均没有扩增曲线,重复性试验的变异系数小于2%,表明建立了特异性强、重复性好、灵敏性高的PRV-gB基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。用该方法检测8种商品伪狂犬病弱毒活疫苗的每头份剂量的病毒载量,结果显示不同商品伪狂犬病弱毒活疫苗之间的病毒载量存在明显差异,与其标识剂量基本一致,表明该荧光定量PCR检测方法可用于疫苗剂量检测。     

伪狂犬病病毒gE基因荧光定量PCR检测方法的建立

伪狂犬病病毒(PRV)野毒有gE基因,而其疫苗毒株无gE基因,这为检测有无PRV野毒感染提供参考。用PCR方法扩增PRV的gE基因片段,构建含有PRV gE基因片段的重组质粒。以系列稀释后的重组质粒作为模板,应用SYBR GreenⅠ来进行检测PRV gE基因的实时荧光定量PCR扩增。结果显示:在(6.9×107~6.9×101)copies/μL范围内,相邻扩增曲线之间间距均匀,所有产物具有单一整齐的熔解曲线峰,标准曲线具有优良的线性关系。该方法最低可准确检测69copies/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于2%,对PRV-gE基因缺失疫苗毒株和常见猪源DNA病毒的检测结果均为阴性,对临床样品的检出率高于常规PCR方法。研究结果表明,建立了1种特异性强、灵敏度高、重复性好的检测PRV gE基因的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,可用于PRV野毒感染的定量检测。     

猪圆环病毒2型Taqman探针法实时荧光定量PCR检测方法的建立

猪圆环病毒2型（PCV2）是一种引起仔猪Sus scrofa多系统衰竭综合征、免疫抑制、皮肤肾病综合征等疾病的病原体。根据GenBank中PCV2 ORF1基因序列设计合成特异性引物和探针,以PCV2基因组DNA为模板,通过聚合酶链式反应（PCR）扩增目的片段,并将目的片段克隆至pMD18-T载体,构建阳性标准品。以阳性标准品为模板,优化荧光定量PCR反应条件,建立标准曲线,进行灵敏性、重复性和特异性验证,并应用此方法对临床样品进行检测。结果表明:阳性质粒标准品构建成功,该检测方法的引物与探针的最佳浓度皆为0.2 μmol·L-1,线性检测范围为2.1×1013~2.1×106拷贝·L-1,最低检测限值为8.828×106拷贝·L-1,且与其他相关疾病无交叉反应;各批次检测变异系数低,检测方法稳定性好。本研究建立的敏感性高、特异性好的实时荧光定量PCR方法,为PCV2的快速检测提供了新工具。     

布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法的建立

[目的]根据DNA序列数据库上已公布的布鲁氏菌外膜蛋白(outer membrane protein,Omp)Omp 25基因,设计一对引物和荧光探针,通过反应体系优化,建立一种布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法.[方法]以构建的外膜蛋白目的片段重组质粒为标准品,验证该方法的灵敏度、特异性,通过优化反应条件,建立标准曲线.通过对34份已知临床背景的样品检测,验证该方法的敏感性.[结果]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法,特异性验证符合率100％,最低检测限约为100 copies/μL,敏感度的检出率为100％,建立标准曲线的R2为0.994,扩增效率99.73％.[结论]建立的布鲁氏菌荧光定量PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,可以用于布鲁氏菌的检测.     

猪GM-CSF荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪粒细胞一巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因序列设计一对引物,用RT—PCR技术从猪外周血单个核细胞中扩增出296bpcDNA片段,并克隆到pGEM—TEasy载体中。经测序鉴定后,构建出含猪GM—CSFcDNA部分片段的重组质粒。通过重组质粒的Real—timePCR方法,建立了猪GM-CSFcDNA的Real—timePCR标准曲线及其直线回归方程。该方法重复性好,敏感性高、特异性强,可用于猪GM—CSFmRNA水平的定量检测。     

猪白细胞介素-8荧光定量PCR检测方法的建立

用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞总RNA中扩增出猪白介素（IL）-8基因的278 bp cDNA片段,并克隆到pGEM-T Easy载体中,构建成含有猪IL-8 cDNA片段的重组质粒。通过质粒的Real-time PCR方法,建立猪IL-8 cD-NA的Real-time PCR标准曲线。该方法特异性强、灵敏度高、重复性强,可用于猪IL-8 mRNA含量的定量检测。     

猪圆环病毒多重PCR检测方法的建立

为建立PCV1和PCV2混合感染快速检测的PCR方法,根据GenBank已发表PCV1和PCV2全基因组序列,设计合成4条引物,通过PCV1和PCV2阳性质粒的构建、反应条件的优化、敏感性试验和特异性试验,建立了PCV多重PCR检测方法,可扩增出PCV1和PCV2长度分别为726 bp和433 bp特异性目的基因片段。结果显示,建立的PCV多重PCR可检测到5×101个拷贝的PCV1和PCV2目的基因,HCV、PRV、PPV核酸扩增均为阴性,具有良好的特异性和敏感性。并初步应用建立的方法对42份采自四川省部分地区的样品进行检测,结果表明,PCV1阳性率为33.3%,PCV2阳性率为45.2%,其中PCV1和PCV2混合感染阳性率为16.6%。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用

参照GenBank收录的猪圆环病毒2型(PCV2)基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针,并对其进行了筛选;对荧光定量PCR的反应条件进行了优化,建立了TaqM an荧光定量PCR检测方法.用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测,并与常规PCR检测方法作比较.结果显示,所建立的方法灵敏度可达3×101拷贝.μL-1,比常规PCR检测方法灵敏度高10倍,而与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)没有交叉反应,具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点,适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断.     

副结核分枝杆菌hsp65基因的克隆及序列分析

以副结核分枝杆菌C-2株基因组DNA为模板,以hsp65基因特异性引物进行PCR扩增,获得了1 626 bp的DNA片段.通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T载体.经鉴定,成功地构建出了重组质粒pGEM-T-hsp65.序列分析结果表明:该序列与GenBank中副结核分枝杆菌K～10株的同源性为99.2%.     

猪IL-18 mRNA定量RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪白介素(IL)-18基因序列,设计1对引物,用RT-PCR技术从猪肺泡巨噬细胞总RNA中扩增出其411 bp cDNA片段,将其与pGEM-T Easy载体连接,经转化、筛选阳性克隆、酶切与测序鉴定后,构建出含猪IL-18 cDNA部分片段的重组质粒。后用反向PCR技术构建出与扩增411 bp片段共用同1对引物,但缺失174 bp的竞争重组质粒。通过上述2种质粒的竞争PCR方法,建立了猪IL-18 mRNA的标准竞争曲线,得到其直线回归方程^y=0.583 2x-2.903 4(R2=0.9898)。     

牛分枝杆菌RecA基因的克隆与序列分析

以牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)Valleelll株染色体DNA为模板,以RecA基因特异性引物进行PCR扩增,获得约240 bp的DNA片段.将PCR产物克隆至pMDTM18-T Vector中,通过α-互补法筛选、质粒PCR鉴定及序列分析鉴定,成功构建出了重组质粒pMDTM18-T-RecA,为进一步研究RecA基因及其在牛结核病诊断中的应用奠定了基础.     

多重实时定量PCR快速检测PRRSV、CSFV和PCV2混合感染方法的建立

根据TaqMan复合荧光探针设计原则,应用Primer 5.0和Oligo 6.0软件设计检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的特异性引物和探针,优化反应条件,建立了检测PRRSV、CSFV和PCV2的单项和多重Real-time PCR方法。结果表明,建立的方法具有高度特异性,与其他病原检测无明显交叉反应;对阳性质粒和病毒的最低检测量分别为<101个拷贝和<1TCID50/反应,检测灵敏度比常规PCR检测高100倍。通过对20份临床样本进行检测,多重Real-time PCR检测结果和单项Real-time PCR检测结果一致。建立的多重Real-time PCR方法可用于同时快速检测PRRSV、CSF和PCV2的混合感染,具有灵敏、特异、重复性好并能对样品进行定量检测等优点。     

检测猪繁殖与呼吸综合征病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用

利用反转录PCR （RT-PCR）技术扩增出猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5基因部分片段,并克隆到pGEM-T Easy载体上,得到重组质粒作为荧光定量PCR检测的标准模板,以10倍梯度稀释模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立PRRSV的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,与猪圆环病毒、猪乙型脑炎病毒、猪伪狂犬病毒、猪瘟病毒、猪流感病毒和猪细小病毒不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性;对16份临床疑似病料进行了检测,发现15份均为荧光定量PCR阳性,而常规RT-PCR只能检测出12份阳性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PRRSV感染的早期诊断以及分子流行病学调查。