香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系的建立

【目的】建立香蕉CRISPR/Cas9基因编辑技术体系,为在香蕉上利用CRISPR/CAS9技术开展香蕉基因功能研究和香蕉育种工作开辟新的路径。【方法】根据香蕉A基因组八氢番茄红素脱氢酶(phytoene dehydrogenase,PDS)基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2确定合适的CRISPR/Cas9靶标序列,选择其中一个位点作为靶标位点,设计包含靶标基因MaPDS序列的sgRNA。利用一套改良的CRISPR/Cas9多靶点载体系统,以pYLg RNA-Lac Z-U6a质粒为模版,Overlapping PCR法构建U6a-sgRNA表达盒,再利用Golden Gate Cloning法将U6a-sgRNA表达盒克隆到pYLCRISPR/Cas9载体中,构建以MaPDS为靶标基因的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。构建的质粒含Cas9p和sgRNA表达盒,其中Cas9p由P_(Ubi)启动子驱动,sgRNA由水稻来源的RNA启动子U6a驱动。将构建好的载体转入农杆菌EHA105,转化香蕉主栽品种巴西蕉胚性细胞悬浮系,获得抗性再生植株。设计PCR引物扩增包含靶标序列的MaPDS序列片段,检测和分析再生植株MaPDS被编辑的情况。【结果】试验选择MaPDS作为CRISPR/Cas9靶标基因,设计一个靶标位点,利用Overlapping PCR法获得了U6a-sgRNA表达盒,利用Golden Gate Cloning法将其克隆到pYLCRISPR/Cas9的Bsa I位点,成功构建了针对MaPDS的pYLCRISPR/Cas9-sgRNA载体。经过农杆菌浸染、抗性筛选、抗性胚诱导、萌发及生根,最终获得抗性独立转化株系129个。其中,71个株系出现白化表型,产生白化表型的几率达55%。失绿突变体的出现意味着MaPDS蛋白功能丧失。随机取转化株系中的白化表型株系33个和正常表型株系14个,提取其叶片基因组DNA,扩增含有MaPDS的靶位点片段,序列分析结果表明,白化表型株系的MaPDS靶位点序列发生了基因编辑。主要是在靶位点附近增加1个碱基T或A,或是在靶位点附近或下游发生碱基颠换或转换,出现非靶标位点突变。这些突变形式均能导致MaPDS蛋白翻译错误,从而使MaPDS蛋白丧失功能,表现为白化。转化株系中表型正常植株的MaPDS靶位点序列与野生型一致,未检测到变异。【结论】成功在香蕉体内实现了对内源MaPDS的定点敲除,获得了基因定点敲除的突变体株系,为进一步利用基因编辑技术在香蕉上的应用奠定了基础。     

山黧豆CASase基因DNA全长序列的扩增及CRISPR/Cas9敲除载体的构建

【目的】克隆山黧豆β-腈基丙氨酸合成酶基因(CASase)DNA全长序列,构建CRISPR/Cas9敲除载体,为筛选"低毒、高硫"山黧豆品系奠定基础。【方法】以萌发4d山黧豆幼苗根部为材料,提取其基因组DNA,利用PCR克隆CASase基因全长;经序列同源性、内含子、外显子、sgRNA靶位点和脱靶分析后,在CASasecDNA上选取5个sgRNA靶位点进行寡核苷酸链设计和体外活性检测;从5个sgRNA靶位点中取活性较高的4个sgRNA,利用酶切连接法构建基因敲除载体pPLHACas9-sgRNA20r、pPLHACas9-sgRNA68r、pPLHACas9-sgRNA225f和pPLHACas9-sgRNA256f。【结果】获得了CASase基因3 143bp的DNA全长序列,该序列编码β-腈基丙氨酸合成酶;在CASase cDNA中选取5个sgRNA靶位点在体外均能有效剪切靶序列;菌落PCR检测结果显示,4个CRISPR/Cas9基因敲除载体构建成功。【结论】克隆了山黧豆CASase基因DNA全长,成功构建了该基因上4个sgRNA靶位点的CRISPR/Cas9敲除载体。     

1种简单快速高效的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法

基于Golden Gate载体构建过程,对CRISPR/Cas9双靶点敲除技术的载体构建系统进行了优化,建立了一种简单快速高效且无PCR扩增的双靶点CRISPR/Cas9载体构建方法。在本方法中,只需将设计好的2个靶点DNA小片段和1个外源片段用T4DNA连接酶构建到CRISPR/Cas9载体上即可。用本方法对10个已报道的水稻基因构建了20个双靶点CRISPR/Cas9载体,阳性率为100%,测序结果显示无突变。该载体系统非常适合大批量CRISPR/Cas9载体的构建,同时也为其他植物中构建双靶点CRISPR/Cas9载体提供借鉴。     

拟南芥Ib bHLH家族基因CRISPR/Cas9敲除载体的构建

[目的]全氟辛酸(PFOA)处理能显著诱导拟南芥Ib bHLH(Ib basic helix-loop-helix)家族4个转录因子bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101的转录水平。为了进一步分析这4个基因在响应PFOA中的潜在作用,利用CRISPR/Cas9技术构建了它们的共敲除载体。[方法]以野生型拟南芥基因中的外显子为模板,设计引物,通过两步PCR扩增法将靶向基因连接到CRISPR/Cas9载体上;将构建成功的重组质粒转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中,挑取阳性菌落,PCR鉴定正确后,将其质粒转入农杆菌GV3101感受态细胞中,再次挑取阳性菌落进行PCR鉴定正确后,提取质粒进行表达盒测序。[结果]通过两步PCR扩增法,成功将4个靶点表达盒转入到CRISPR/Cas9载体中,构建了bHLH38、bHLH39、bHLH100和bHLH101的双元CRISPR/Cas9敲除载体。[结论]成功构建的Ib BHLH家族CRISPR/Cas9敲除载体,为后续拟南芥Ib BHLH家族四突突变体材料的获得提供了可用性载体。     

利用CRISPR技术鉴定拟南芥miR171a的功能

miRNA是一段长约21 nt的RNA小分子,能够影响多种植物生理生化功能。CRISPR/Cas9是近年发展的可以靶向编辑DNA序列的技术,已广泛应用于多种植物。miR171a是一类保守的miRNA家族,参与对植物生长发育和逆境胁迫的调控。利用CRISPR/Cas9技术鉴定拟南芥miR171a的功能,结果表明基因编辑拟南芥株系中的miR171a表达量降低,靶基因SCL22表达量上调。干旱处理后基因编辑拟南芥株系中的脯氨酸含量上升幅度小于野生型。基因编辑拟南芥株系的叶绿素含量有不同程度的降低,株高和生长势增强。干旱胁迫结果显示对miR171的抑制使得拟南芥抗旱能力减弱,表明利用CRISPR技术鉴定miRNA的功能是有效的。     

茶炭疽菌中CRISPR/Cas9敲除系统构建

【目的】以调控茶树炭疽病菌(Colletotrichum camelliae)中的植物真菌毒素(Solanapyrones)合成的CcSOL4为例，构建CRISPR-Cas9的基因敲除载体系统，为CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术在茶炭疽菌中的应用奠定基础。【方法】通过对转录因子CcSOL4的基因序列分析，选择5个靶点以PCBC载体为模板扩增目的片段，再与表达载体PKSE401发生重组构建基因标记载体。以携带Cas9编码基因的PKSE401双元双靶点载体系统为骨架，以PCBC载体为模板扩增相应的sgRNA,运用Overlapping PCR以及Golden Gate Cloning技术构建针对炭疽病的双靶点和三靶点CRISPR/Cas9编辑载体。【结果】双靶点载体片段及三靶点载体片段扩增后大小为650～750 bp,将上述PCR片段连入载体PKSE401,双靶点载体1Sol4和2Sol4经阳性鉴定得到650 bp片段，三靶点载体3Sol4经阳性鉴定后得到1 200 bp的片段。【结论】重组载体构建成功，并建立了茶炭疽菌C.camelliae的CRISPR/Cas9敲除体系。     

罗汉果SgARF9基因克隆及其CRISPR/Cas9基因编辑载体构建

[目的]研究SgARF9基因与罗汉果果实发育的关系。[方法]在转录组Unigene序列基础上,对罗汉果SgARF9基因进行克隆,并结合CRISPR/Cas9基因编辑技术,构建以SgARF9为靶基因的CRISPR/Cas9基因编辑载体。[结果]克隆得到SgARF9基因序列,且成功构建包含SgARF9基因靶点的编辑载体。[结论]该研究为揭示SgARF9基因的分子生物学功能,明确其在罗汉果果实起始发育中的遗传调控机制提供了基础。     

猪miR-22前体上游序列突变的PK15细胞系构建

猪miR-22前体上游序列片段突变可能对miR-22的表达起到重要调控作用,为进一步探究其功能,基于CRISPR/Cas9基因编辑技术,通过针对猪miR-22前体上游序列片段设计2个靶标sgRNAs(short guide RNAs),构建重组表达载体pX459-sgRNA1和pX459-sgRNA2;随后将重组质粒转染猪肾上皮细胞系(PK15),经嘌呤霉素初步筛选后,提取基因组DNA,通过PCR及测序鉴定编辑效果;最后,通过实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)检测编辑前后miR-22相对表达量的变化。结果显示,81个阳性克隆中,共产生6种突变类型,突变率达60.49%;qRT-PCR检测显示,编辑后miR-22的表达量显著下调约50%。本研究成功获得了miR-22前体上游序列突变的猪PK15细胞模型,为今后猪miR-22的功能研究提供了新的可应用研究对象。     

靶向敲除绒山羊lnc15479的CRISPR/ Cas9构建及活性验证

为研究生长期和休止期lnc15479的差异表达在陕北白绒山羊毛囊周期性发育中的作用及功能,利用CRISPR/Cas9技术,在lnc15479的上、下游各设计1个sgRNA靶位点,构建CRISPR/cas9表达载体;并基于SSA修复机制,分别构建含有红色和绿色荧光标记的双荧光报告载体系统。通过将表达载体和报告载体共同转染HEK293T细胞,检测该CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明,lnc15479的CRISPR/Cas9表达载体成功构建,根据红色和绿色荧光表达情况及细胞计数的方法,该系统的工作效率约为20%。研究结果为进一步分析lnc15479的功能提供技术支持。     

丝瓜LcPPO1基因CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建

[目的]通过CRISPR/Cas9系统构建丝瓜LcPPO1基因编辑载体.[方法]根据前期已经克隆得到的LcPPO1基因序列,设计2个sgRNA靶位点序列,退火制备sgRNA双链,分别与线性PCA1301-Cas9载体连接获得2个重组载体,将重组载体转化DH5α感受态细胞,再对其进行PCR鉴定及测序比对分析.[结果]2个sgRNA靶位点序列已经分别准确地连入PCA1301-Cas9载体,插入序列无突变.[结论]成功构建了丝瓜LcPPO1基因编辑载体PCA1301-Cas9-sgRNA1和PCA1301-Cas9-sgRNA2,为后续研究丝瓜LcPPO1基因功能奠定了基础.     

利用pHDE-Cas9构建巨桉CTX基因家族CRISPR载体

[目的]利用高效基因编辑系统(pHDE-Cas9)构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CTX)基因家族规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)载体,为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础.[方法]设计巨桉CTX基因靶位点和引物,扩增pCBC质粒上的目的片段,BsaⅠ酶切pHDE载体并与目的片段连接形成重组质粒,转化DH5α感受态细胞.提取单克隆进行菌液PCR初步验证、重组质粒PCR验证,挑选阳性克隆质粒进行测序分析,构建CTX基因家族CRISPR载体.[结果]重组质粒PCR鉴定及测序结果表明,重组载体序列无突变,与预期序列高度一致.成功构建了巨桉CTX基因家族pHDE-CTXA、pHDE-CTXB和pHDE-CTXC同源表达载体.[结论]利用pHDE-Cas9成功构建了巨桉CTX基因家族CRISPR载体,构建过程快速、高效,为桉树基因组定点编辑打下了基础,也可为其他桉树CRISPR/Cas9表达载体的构建提供借鉴.     

CRISPR/Cas9介导的绵羊示踪脐带间充质干细胞系的建立

【目的】利用CRISPR/Cas9技术建立绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞的临床治疗与分化机制研究奠定基础。【方法】根据绵羊ROSA26的基因组序列,利用在线工具ZiFiT Targeter Version 4.2设计合成3对引物,利用点突变法,以px330质粒为模板分别进行PCR,DpnⅠ去除质粒DNA后,PCR产物自身环化,酶切测序鉴定,构建以绵羊Rosa26为靶标基因的sgRNA/Cas9载体,构建的质粒含Cas9和向导RNA(single-guide RNA,sgRNA) 表达盒,由U6启动子驱动表达。将上述载体分别利用脂质体转染绵羊脐带间充质干细胞(sUMSCs),提取其基因组PCR后进行T7E1酶切,琼脂糖电泳分析条带灰度以检测载体编辑活性。根据sgRNA序列在绵羊ROSA26靶位点的上下游设计并合成左、右同源臂扩增引物,提取绵羊全基因组为模板分别进行PCR扩增得到左右同源臂,回收纯化后分别与pMD19-Simple连接,酶切测序鉴定获得左、右同源臂重组质粒。根据PCR引入的酶切位点,将左同源臂质粒和Donor表达载体DC-DON-SH02 ROSA26进行酶切连接,鉴定获得左臂重组打靶载体,使用相同方法将右同源臂质粒连接到左臂打靶载体上,鉴定获得Donor打靶载体,载体携带嘌呤霉素抗性基因和绿色荧光蛋白（GFP）报告基因。在生长良好的sUMSCs中加入不同浓度的嘌呤霉素,观察细胞存活时间,确定最佳抗性筛选浓度和时间。利用脂质体共转sgRNA/Cas9载体和Donor载体到绵羊间充质干细胞,在其ROSA26位点切割DNA双链,在DNA断裂处通过同源重组方式引入报告基因,转染48 h后进行嘌呤霉素抗性筛选,筛选结束后更换正常培养基继续培养,观察绿色荧光的表达并提取阳性细胞基因组,针对ROSA26位点设计上下游两对引物对其进行PCR检测其整合情况。【结果】（1）针对绵羊Rosa26位点设计3对PCR引物,利用点突变法将sgRNA 克隆至px330的BbsⅠ酶切位点上,成功构建sgRNA/Cas9载体px330-sgRNA1/2/3,将其分别转染sUMSCs,T7E1酶切结果表明px330-sgRNA2/3出现脱靶现象,未在靶位点发生编辑,px330-sgRNA1的编辑效率最高,约为20%;（2）基于sgRNA1,PCR法获得打靶载体的左、右同源臂,经一系列分子生物学方法先后连接到载体DC-DON-SH02 ROSA26上,经酶切和PCR鉴定,成功获得绵羊ROSA26位点的重组载体sROSA26-HA;（3）筛选得到sUMSCs最佳抗性浓度时间,利用Lipofectamine2000共转染sgRNA/Cas9载体和Donor重组载体到sUMSCs,1.5 μg·mL^-1嘌呤霉素筛选15d至对照组细胞全部死亡,获得的阳性克隆并扩大培养。显微镜下可观察到明显的绿色荧光,且与对照组相比,阳性细胞克隆的基因组PCR均检测到特异条带,表明sUMSCs的ROSA26位点发生同源重组,GFP基因被成功敲入到基因组中并能正常表达,该细胞可以用于动物疾病模型中追踪sUMSCs的去向和分化方向的研究。【结论】成功利用CRISPR/Cas9系统在sUMSCs内实现外源GFP基因的定点敲入,获得绵羊示踪脐带间充质干细胞系,为间充质干细胞进一步的临床转化奠定了基础。     

基于CRISPR/Cas9技术构建猪miR-136基因编辑载体

为了阐明microRNA对猪产仔数的调节机制,采用CRISPR/Cas9技术构建针对猪miR-136的基因编辑表达载体。通过实验,在miR-136基因成熟区及其下游设计两个单链引导RNA(sgRNA),合成4条磷酸化的单链DNA寡核苷酸,复性后形成两条带粘性末端的双链寡核苷酸片段,插入线性化的载体pX462的BpiI酶切位点处,转化感受态大肠杆菌DH5α,经测序确认,得到两个编辑表达载体pX462-miR-136-1和pX462-miR-136-2。构建了两个编辑miR-136基因的表达载体,为猪繁殖力的调控研究奠定了技术基础。     

番茄U6启动子的克隆及CRISPR/Cas9基因编辑体系的建立

【目的】从番茄中克隆高效转录的SlU6启动子,构建CRISPR/Cas9基因编辑载体,并在番茄中建立CRISPR/Cas9系统,为番茄功能基因组学和分子育种研究提供技术基础。【方法】采用PCR方法从‘中蔬四号’番茄品种中克隆4种SlU6启动子,利用Transfer PCR方法分别对4个启动子进行两种不同长度的截短,分别构建8个截短的SlU6启动子驱动GUS的植物融合表达载体。利用农杆菌瞬时转化法分别转染番茄叶片,通过GUS染色筛选出在番茄叶片中转录活性较高的SlU6-2启动子。采用DNA重组技术构建以SlU6-2为启动子驱动sgRNA,以番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体。载体构建成功后,采用PEG法转化番茄原生质体,提取基因组DNA,采用酶切/PCR法分析内源基因突变情况;采用测序法分析内源基因突变的类型。利用突变位点频率分布图来验证番茄内源启动子在番茄CRISPR/Cas9系统中的有效性。【结果】经过两轮PCR,共获得4种8个不同长度的番茄U6启动子,其长度分别是452、202、448、206、433、190、448和218 bp,启动子序列比对分析发现番茄U6启动子与拟南芥U6启动子一样,也含有比较保守的两个元件,USE和TATA框。成功构建了8个SlU6启动子分别驱动GUS的植物融合表达载体。番茄叶片染色结果显示转化后的番茄叶片均被染成蓝色,表明克隆的番茄8个SlU6启动子均具有转录活性。选择SlU6-2P4为启动子驱动sgRNA,成功构建番茄白粉病相关基因MLO1和EDR1为靶序列的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,验证结果表明番茄内源启动子SlU6-2P4能有效地驱动sgRNA的转录,并成功实现对番茄内源基因的编辑。内源基因突变的类型都为碱基替换,突变热点仅存在于内源基因靶序列区。【结论】成功克隆了4种在番茄叶片中高效转录的SlU6启动子;基于SlU6-2启动子的CRISPR/Cas9基因组编辑载体,在番茄中成功实现对内源基因的编辑。     

靶向加工番茄elF4E1的CRISPR/Cas9载体有效性验证

【目的】验证基于CRISPR/Cas9系统构建的靶向编辑加工番茄(Solanum lycopersicum) eIF4E1基因载体的有效性,为CRISPR/Cas9系统在培育PVY抗性植株中的应用提供技术支持。【方法】构建靶向编辑番茄真核翻译起始因子elF4E1基因的CRISPR/Cas9系统表达载体,用农杆菌渗透法瞬时转化番茄植株,PCR扩增已转化植株靶位点周围DNA序列后用HaeⅢ进行酶切,回收未切开的条带与pGEM-T载体连接后进行单克隆测序。【结果】对测得的9个克隆序列进行比对分析,在PAM (protospacer adjacent motifs)上游的6~8 bp的碱基处均发生突变,并且都为单碱基的替换,导致多肽链中单个氨基酸的替换。【结论】利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统构建的载体能够特异性地靶向加工番茄eIF4E1基因,为利用CRISPR/Cas9系统敲除eIF4E1基因,获得抗PVY病毒的番茄育种材料奠定了基础。     

CRISPR/Cas9技术编辑新疆甜瓜全缘叶基因

【目的】以新疆甜瓜地方品种老汉瓜为研究材料,对其全缘叶基因进行基因编辑,构建新疆甜瓜CRISPR/Cas9敲除载体,分析甜瓜耐受潮霉素最大浓度,为研究新疆甜瓜裂叶基因的功能奠定基础。【方法】在课题组前期确定甜瓜全缘叶基因PLL的基础上,结合甜瓜基因组数据,设计PLL基因外显子的特异靶位点,构建甜瓜全缘叶基因PLL的CRISPR/Cas9敲除载体,将构建好的载体转化到大肠杆菌中,并测序验证,然后对甜瓜耐受潮霉素浓度进行分析。【结果】针对全缘叶基因PLL外显子选择一个长约20 bp的靶位点,根据靶位点设计sgRNA框,并成功将其构建到CRISPR/Cas9敲除载体上,然后将载体成功转化到大肠杆菌中。分析出甜瓜可耐受潮霉素的最大浓度为10 mg/L。【结论】成功获得甜瓜全缘叶基因PLL的敲除载体,并转化到大肠杆菌中。分析出甜瓜耐受潮霉素的最大浓度,为进一步利用CRISPR/Cas9基因编辑技术研究新疆甜瓜裂叶基因pll的功能奠定基础。     

CRISPR/Cas13b系统对猪流行性腹泻病毒增殖的抑制作用

【目的】猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一种对养猪业造成巨大损失的高致死率的传染性疫病。CRISPR/Cas13b系统精准切割和编辑RNA的功能提供了一种靶向抑制RNA病毒的策略。本研究尝试利用CRISPR/Cas13b的RNA干扰功能对PEDV的基因组RNA进行切割,以探索一种新型的PEDV病毒抑制策略。【方法】设计了4对靶向PEDV基因组不同区域的CRISPR RNA(crRNA)位点,构建了CRISPR/Cas13b打靶载体,以打靶载体转染Vero细胞,并利用PEDV感染转染细胞,检测PEDV在CRISPR/Cas13b转染细胞内的增殖情况。【结果】CRISPR/Cas13b系统对PEDV在Vero细胞的增殖具有明显的抑制作用。打靶载体U6-crRNA3和U6-crRNA4转染组相较于正常细胞组,病毒免疫荧光试验中荧光团明显减少;定量PCR结果显示,打靶载体转染组在细胞水平抑制50%以上病毒增殖量。【结论】本研究构建的CRISPR/Cas13b系统能有效抑制PEDV增殖,为开发有效的RNA病毒防控手段、建立抗病动物模型提供了新的研究策略。