利用CRISPR技术鉴定拟南芥miR171a的功能

miRNA是一段长约21 nt的RNA小分子,能够影响多种植物生理生化功能。CRISPR/Cas9是近年发展的可以靶向编辑DNA序列的技术,已广泛应用于多种植物。miR171a是一类保守的miRNA家族,参与对植物生长发育和逆境胁迫的调控。利用CRISPR/Cas9技术鉴定拟南芥miR171a的功能,结果表明基因编辑拟南芥株系中的miR171a表达量降低,靶基因SCL22表达量上调。干旱处理后基因编辑拟南芥株系中的脯氨酸含量上升幅度小于野生型。基因编辑拟南芥株系的叶绿素含量有不同程度的降低,株高和生长势增强。干旱胁迫结果显示对miR171的抑制使得拟南芥抗旱能力减弱,表明利用CRISPR技术鉴定miRNA的功能是有效的。     

小麦TaBG的克隆及其在花药开裂中的潜在功能

【目的】β-葡萄糖苷酶（4-β-D-glueosidase,BG）是一种水解酶,可以从糖聚合物或寡聚糖中水解糖苷键释放出非还原性糖基,对控制花药开裂具有重要作用。小麦光温敏雄性不育系BS366在不育环境下花药不开裂,在可育环境下花药开裂或不完全开裂。从BS366中克隆TaBG,分析其在花药开裂中的潜在功能,为进一步解析小麦光温敏雄性不育系花药开裂异常的分子机理提供理论基础。【方法】以不育系BS366花药的cDNA为模板,克隆TaBG;利用生物信息学软件对TaBG及其蛋白结构进行预测,构建系统进化树、预测互作蛋白并对TaBG进行上游启动子元件以及互作miRNA预测;构建TaBG-16318hGFP载体,观察其在小麦原生质体中的亚细胞定位;使用实时荧光定量PCR（qPCR）方法测定TaBG在不育环境、可育环境下不同发育时期花药中的表达量,以及MeJA处理下TaBG及与其互作的tae-miR395a在花药和颖壳中的表达模式。【结果】TaBG属于糖基水解酶超家族基因,全长为1 473 bp,编码490个氨基酸,蛋白理论等电点为8.12,属于不稳定的亲水性蛋白。通过miRNA互作预测,发现TaBG可能受miR169、miR395a等抗逆性相关的miRNA调控。通过蛋白互作预测,发现TaBG可能与氧化还原酶（glucose-methanol-choline oxidoreductase,GMC）、内切葡聚糖酶（endoglucanase,EG）等蛋白互作。TaBG定位于小麦原生质体的液泡中。qPCR结果表明,TaBG在花药发育双室期（stage13)、花药开裂时期（stage14）和衰退期（stage15）中的表达量呈现先升高后下降的趋势。在花药开裂时期表达量最高,并且在不开裂花药中的表达量是正常开裂花药的2.8倍。经MeJA处理后,花药和颖壳中的TaBG均呈下调表达,tae-miR395a表达模式与其相反。【结论】TaBG可能受miR169、miR395a等抗逆相关miRNA的调控,参与花药开裂调控。由于TaBG表达量的升高,增加了不育环境下花药中可溶性糖的含量,进而增加花药中的渗透势,从而减缓花药开裂时的脱水活动,导致花药不开裂。     

杜氏盐藻甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因在棉花中的转化及分子检测

根据NCBI核酸数据库中杜氏盐藻耐盐基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(dunaliella salina glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,Ds GAPDH)的c DNA全长序列信息,本研究利用RT-PCR技术扩增克隆该基因,获得完整全长为1 131 bp并编码376个氨基酸的多肽的ORF序列。生物信息学分析表明:Ds GAPDH编码的蛋白与拟南芥、蒺藜苜蓿、玉米和葡萄等物种高度同源,分别达到90%、92%、96%和97%。构建的系统发育树结果显示,该基因编码的蛋白与团藻中该蛋白的亲缘关系最为接近。该蛋白主要由四种二级结构即α-螺旋、β-折叠、转角和无规则卷曲等组成。构建p BI121-Ds GAPDH植物表达载体,以非抗虫棉F12A、F12B和HU-749513为材料,利用基因枪活体技术转化棉花花粉,并对T0代种子进行分子检测和相关序列验证,成功获得两株阳性转基因植株,为基因枪活体转化技术研究奠定了一定的实践基础,同时也为棉花耐盐机制的研究提供了新材料。     

氮密互作对夏玉米产量性状及氮素利用的影响

以夏玉来杂交种登海661为材料,对不同种植密度和不同施氮水平下夏玉米的产量性状和氮素利用状况进行了研究.试验结果表明,不同密度和施氮量对玉米的产量和籽粒质量影响显著,通过增加产穗数增加667m2产量,但是密度和氮素互作效应不显著.同时,每667m2施N16kg相对于其他施氮处理更有利于促进玉米叶绿素积累,促进植株的光合作用.适量施氮,可促进籽粒发育,减少败育,增加稳粒数,增加产量;同时促进植物体吸收的氮素高效地向籽粒中分配,提高氮肥的利用率;使玉米叶片维持较高的光合性能,为籽粒形成提供充足的光和碳量,井促进营养体碳氮向籽粒转运.     

小麦TaPIP1基因克隆及其在花药开裂中潜在功能分析

二系杂交小麦育种是小麦产量提高的重要途径之一。光温敏雄性不育小麦生殖生长过程中花药的发育及开裂情况直接影响杂交小麦的制种效率和产量。植物花药的开裂与脱水活动紧密相关。水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是高效转运水分及特异小分子的膜内在蛋白,其中质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)在水分的吸收与外排中发挥着重要作用。为进一步了解水通道蛋白在小麦光温敏核雄性不育系花药开裂中的作用提供理论基础。本研究以不育系BS366花药的cDNA为模板,克隆获得了TaPIP1基因。利用生物信息学软件对TaPIP1进行分析,该基因包含一个879 bp的开放阅读框,编码292个氨基酸。TaPIP1的启动子区存在赤霉素、脱落酸、茉莉酸和光等响应元件。TaPIP1属于MIP超家族,具有典型的NPA保守结构域,亚细胞定位于细胞质膜与核膜上。miRNA互作预测发现TaPIP1受tae-miR1131与tae-miR408的剪切抑制,表明TaPIP1可能和与植物的抗氧化能力相关。通过蛋白互作预测及qPCR实验,表明TaPIP1可与热激蛋白(heat s...     

胡麻株高QTL定位与候选基因功能分析

胡麻(Linum usitatissimum L.)是我国主要油料作物之一，具有较强的耐旱、耐寒、耐贫瘠特性，株高不仅影响胡麻产量，同时与植株倒伏性相关，对胡麻籽品质也有一定影响。以加拿大油用亚麻品种Macbeth和中国纤用亚麻品种黑亚14号为亲本构建的包含155个株系的重组自交系群体为试验材料，统计了该群体在甘肃兰州和景泰、云南元谋及河北廊坊四点的株高性状，挑选在四个环境株高表现一致的高、低单株构建混合池进行QTL-seq。将分析结果和QTL定位结果进行比较分析后确认了QTL候选区段，锁定了一个胡麻株高候选基因LuCWINV1-1，其属于酸性转化酶中的细胞壁转化酶，包含保守的结构域NDPNG、RDP和MWECP。亲本中LuCWINV1-1基因组序列发生突变，导致Macbeth中第21位谷氨酸和第523位异亮氨酸在黑亚14中分别为甘氨酸和丙氨酸。通过转化拟南芥发现，两个亲本的等位基因对株高起着不同的效应作用，LuCWINV1-1Mac转基因株系的株高变低，LuCWINV1-1Hei转基因株系变高，表明该基因在胡麻中控制株高。上述结果为解析胡麻株高机制奠定了基础，同时，也探索出在小基因组作物中利用QTL-seq快速能有效克隆QTL候选基因，为后续鉴定克隆控制胡麻重要农艺性状的基因提供技术支撑。     

一种快速有效油用亚麻转基因体系的建立

油用亚麻(俗称胡麻)是我国重要的油料作物之一,也是干旱和半干旱地区的主要经济作物。近年来随着国家经济的发展和人们生活质量的提高,人们对油用亚麻的需求逐渐提升。建立一种快速高效便捷的油用亚麻遗传转化体系对油用亚麻分子育种具有重要意义。本实验以油用亚麻子叶节作为遗传转化的外植体,以草铵膦作为转基因植株筛选剂,通过农杆菌介导法转化油用亚麻,通过对各生长时期生长调节剂的配比筛选,优化出一套转化体系。该体系与传统的以下胚轴为外植体的转化方法相比,成苗时间能缩短至两个月,且阳性植株鉴定方法简便高效。该体系的开发为加快油用亚麻的分子育种与基因相关研究提供了有利条件。     

NaCl和Na_2CO_3对不同棉花基因组的DNA甲基化影响

【目的】探究不同盐胁迫后的棉花基因组DNA甲基化变化情况,并比较分析叶片和根部DNA甲基化变化差异,进而探究DNA甲基化与棉花耐盐性之间的关系。【方法】以陆地棉耐盐品种中9806和盐敏感品种中S9612为试验材料,分别用NaCl和Na2CO3(浓度均为0.4%)处理。提取对照和处理材料的DNA,进行双酶切、连接、预扩增和选择性扩增,然后采用MSAP技术(甲基化敏感扩增多态性)分析棉花幼苗在盐胁迫前后的DNA甲基化情况。从聚丙烯酰胺凝胶中回收纯化多态性片段并进行测序,通过NCBI进行比对分析;设计引物,用实时荧光定量PCR对多态性片段在棉花幼苗中的表达量进行验证。【结果】盐胁迫分析表明不同类型盐胁迫对棉花幼苗的影响不同;0.4%的中性盐NaCl对棉花幼苗的影响相对较小,各部分组织的形态变化不明显,而0.4%的碱性盐Na2CO3对棉花幼苗的影响较大,使棉花幼苗子叶变软,茎基部和根部发黑;MSAP分析结果表明,NaCl胁迫后中9806和中S9612叶片的甲基化比率分别为23.5%和27.7%,其中,全甲基化比率分别为20.3%和22.9%,根部的甲基化比率分别为24.7%和27.1%,其中,全甲基化比率分别为19.6%和21.6%;Na2CO3胁迫后中9806和中S9612叶片的甲基化比率分别为28.9%和28.1%,其中,全甲基化比率分别为24.3%和24.5,根部的甲基化比率分别为25.7%和27.6%,其中,全甲基化比率分别为21.5%和24.0%。叶片和根部甲基化水平存在差异,随着盐类型由中性盐向碱性盐转变的过程中,基因组DNA甲基化水平迅速增加,并在Na2CO3处达到最大值。通过分析胁迫以后的甲基化状态,在NaCl和Na2CO3胁迫后,中9806叶片的甲基化条带所占多态性条带比率分别为40.00%和50.00%,去甲基化条带所占多态性条带比率分别为54.12%和46.67%,中9806根部的甲基化条带所占多态性条带比率分别为35.53%和43.59%,去甲基化条带所占多态性条带比率分别为56.58%和51.28%。而中S9612叶片和根部中的甲基化条带比率和去甲基化条带比率的变化不明显。对多态性片段回收共获得6条序列,这6条序列涉及不同的同源基因,在基因编码区和非编码区均有分布,参与不同的代谢反应。qRT-PCR分析结果表明,6个同源基因在对照和处理之间的表达差异显著。【结论】耐盐性不同的棉花品种对盐胁迫反应不同,耐盐品种中9806在中性盐NaCl胁迫后基因组甲基化水平降低,诱导相关耐盐基因表达来抵抗胁迫而盐敏感品种中S9612则缺乏相应的耐盐基因使植株受到伤害增加,在Na2CO3处理以后受到伤害最大,对照与处理间甲基化水平差异显著,叶片和根部甲基化水平存在差异,具有组织特异性;多态性片段比对分析可知,同源性基因涉及多条代谢途径,通过多种代谢途径间的协同作用来抵抗胁迫。     

NaCl和Na2CO3对不同棉花基因组的DNA甲基化影响

【目的】探究不同盐胁迫后的棉花基因组DNA甲基化变化情况,并比较分析叶片和根部DNA甲基化变化差异,进而探究DNA甲基化与棉花耐盐性之间的关系。【方法】以陆地棉耐盐品种中9806和盐敏感品种中S9612为试验材料,分别用NaCl和Na2CO3（浓度均为0.4%）处理。提取对照和处理材料的DNA,进行双酶切、连接、预扩增和选择性扩增,然后采用MSAP技术（甲基化敏感扩增多态性）分析棉花幼苗在盐胁迫前后的DNA甲基化情况。从聚丙烯酰胺凝胶中回收纯化多态性片段并进行测序,通过NCBI进行比对分析;设计引物,用实时荧光定量PCR对多态性片段在棉花幼苗中的表达量进行验证。【结果】盐胁迫分析表明不同类型盐胁迫对棉花幼苗的影响不同;0.4%的中性盐NaCl对棉花幼苗的影响相对较小,各部分组织的形态变化不明显,而0.4%的碱性盐Na2CO3对棉花幼苗的影响较大,使棉花幼苗子叶变软,茎基部和根部发黑;MSAP分析结果表明,NaCl胁迫后中9806和中S9612叶片的甲基化比率分别为23.5%和27.7%,其中,全甲基化比率分别为20.3%和22.9%,根部的甲基化比率分别为24.7%和27.1%,其中,全甲基化比率分别为19.6%和21.6%;Na2CO3胁迫后中9806和中S9612叶片的甲基化比率分别为28.9%和28.1%,其中,全甲基化比率分别为24.3%和24.5,根部的甲基化比率分别为25.7%和27.6%,其中,全甲基化比率分别为21.5%和24.0%。叶片和根部甲基化水平存在差异,随着盐类型由中性盐向碱性盐转变的过程中,基因组DNA甲基化水平迅速增加,并在Na2CO3处达到最大值。通过分析胁迫以后的甲基化状态,在NaCl和Na2CO3胁迫后,中9806叶片的甲基化条带所占多态性条带比率分别为40.00%和50.00%,去甲基化条带所占多态性条带比率分别为54.12%和46.67%,中9806根部的甲基化条带所占多态性条带比率分别为35.53%和43.59%,去甲基化条带所占多态性条带比率分别为56.58%和51.28%。而中S9612叶片和根部中的甲基化条带比率和去甲基化条带比率的变化不明显。对多态性片段回收共获得6条序列,这6条序列涉及不同的同源基因,在基因编码区和非编码区均有分布,参与不同的代谢反应。qRT-PCR分析结果表明,6个同源基因在对照和处理之间的表达差异显著。【结论】耐盐性不同的棉花品种对盐胁迫反应不同,耐盐品种中9806在中性盐NaCl胁迫后基因组甲基化水平降低,诱导相关耐盐基因表达来抵抗胁迫而盐敏感品种中S9612则缺乏相应的耐盐基因使植株受到伤害增加,在Na2CO3处理以后受到伤害最大,对照与处理间甲基化水平差异显著,叶片和根部甲基化水平存在差异,具有组织特异性;多态性片段比对分析可知,同源性基因涉及多条代谢途径,通过多种代谢途径间的协同作用来抵抗胁迫。